Original title: Využití techniky DGGE k analýze a identifikaci vybraných druhů mikroorganismů
Translated title: Use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms
Authors: Jankeje, Kristína ; Čarnecká, Martina (referee) ; Márová, Ivana (advisor)
Document type: Master’s theses
Year: 2011
Language: slo
Publisher: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract: [slo] [eng]
Predložená diplomová práca je zameraná na využitie techniky DGGE v analýze a identifikácii vybraných druhov mikroorganizmov. PCR-DGGE je metódou, ktorá umožňuje priamu charakterizáciu mikrobiálneho spoločenstva v prirodzenom prostredí, tzn. bez potreby kultivácie. Literárny prehľad sa venuje princípu metódy, súčasným aplikáciam i limitačným faktorom. V experimentálnej časti práce bola izolovaná mikrobiálna DNA, ktorá bola použitá ako templát pre reakciu PCR. S použitím univerzálnych eukaryotických primerov bola amplifikovaná D1/D2 oblasť 26S rDNA. Zvolená bola modifikácia PCR využívajúca vonkajší a vnútorný pár primerov – nested PCR vyznačujúca sa vyššou citlivosťou a špecifitou. Získané amplikóny (asi 250 bp) boli ďalej separované technikou DGGE. Vlastná analýza vybraných mikrobiálnych druhov metódou DGGE bola uskutočnená po optimalizácii základných parametrov (predovšetkým rozsah denaturačného gradientu a celkový čas separácie). Vzájomné rozlíšenie medzi jednotlivými druhmi kvasiniek napriek optimalizácii nebolo možné, keďže každý referenčný druh bol reprezentovaný niekoľkými fragmentmi DNA v tých istých pozíciach. V závere práce je diskutovaný DGGE profil získaný z reálnych vzoriek muštu vínnej révy. Prítomné zóny naznačujú prítomnosť predovšetkým apikulátnych kvasiniek, v malej miere kvasinkového mikroorganizmu A. pullulans a pravdepodobne sacharomycétnych kvasiniek. Technika ostáva otvorená ďalšej optimalizácii, najmä čo sa týka podmienok polymerázovej reťazovej reakcie. Presented diploma thesis is focused on use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms. PCR-DGGE is a method that allows direct characterization of the microbial community in the natural environment without necessity of cultivation. A literature review is devoted to the principle of the method, current applications and its limitations too. In experimental part microbial DNA was isolated and used as a template for PCR reaction. Microbial DNA was then amplified using the universal eukaryotic primers that target the D1/D2 domain of the 26S subunit of ribosomal DNA. To improve specificity and sensitivity of detection nested PCR was chosen using outer and inner primer pairs. Generated amplicons (250 bp) were consequently separated by DGGE. The analysis of selected microorganisms by DGGE technique was performed after optimization of electrophoresis conditions (in particular the denaturing gradient extent and separation time). Despite the optimization, mutual differentiation among individual yeast strains was not possible since each reference strain was represented by several bands in the same positions. In conclusion DGGE profile obtained from wine musts is discussed. Present bands suggest the major presence of non-Saccharomyces yeasts, yeast-like strain A. pullulans is present in the minority and Saccharomyces yeasts are probably present too. The technique remains open for further optimization, particularly as regards the conditions of polymerase chain reaction.
Keywords: DGGE; microbial diversity; polymerase chain reaction; rDNA; wine must; yeasts

Institution: Brno University of Technology (web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library.
Original record: http://hdl.handle.net/11012/2408

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-553909


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Brno University of Technology
Academic theses (ETDs) > Master’s theses