Original title: Rekombinantní exprese a funkční charakterizace rostlinných Kunitzových inhibitorů
Translated title: Recombinant expression and functional characterization of plant Kunitz inhibitors
Authors: Rybáriková, Renata ; Mareš, Michael (advisor) ; Hlouchová, Klára (referee)
Document type: Master’s theses
Year: 2021
Language: cze
Abstract: [cze] [eng]
PDI (z angl. "potato cathepsin D inhibitor") a NID (z angl. "novel inhibitor of cathepsin D") z lilku brambor (Solanum tuberosum) patří do proteinové rodiny Kunitzových inhibitorů (rodina I3 podle databáze Merops). Tyto isoinhibitory s molekulovou hmotností cca 20 kDa a typickou prostorovou architekturou β-trojlístku inhibují aspartátové a serinové peptidasy. Byly připraveny konstrukty pro rekombinantní expresi PDI a NID v kvasinkovém expresním systému Pichia pastoris a vybrány kolonie pro jejich účinnou produkci. Oba proteiny byly identifikovány v kultivačním médiu pomocí hmotnostní spektrometrie a N-koncového sekvenování. Pro PDI byl navržen isolační protokol se třemi chromatografickými kroky. Purifikovaný rekombinantní PDI byl porovnán s nativním PDI z přírodního zdroje a byly prokázány analogické funkční vlastnosti. Analýza inhibiční specifity dále ukázala, že PDI inhibuje vybrané aspartátové peptidasy rodiny A1 a serinové peptidasy rodiny S1 včetně relevantního enzymu hmyzího původu. To podporuje hypotézu o funkci Kunitzových inhibitorů jako obranných molekul rostlin proti herbivornímu hmyzu. Připravené inhibitory budou využity pro analýzu reaktivních center proti cílovým peptidasám pomocí proteinové krystalografie. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, aspartátové a serinové... PDI ("potato cathepsin D inhibitor ") and NID ("novel inhibitor of cathepsin D ") from potato (Solanum tuberosum) belong to the protein family of Kunitz inhibitors (I3 family, Merops database). These 20 kDa isoinhibitors with the typical β-trefoil architecture inhibit aspartic and serine peptidases. In this thesis, the constructs for recombinant expression of PDI and NID in the yeast Pichia pastoris system were prepared and high-producing colonies were selected. Both proteins were identified in the cultivation media by mass spectrometry and N-terminal sequencing. A purification protocol for PDI with three chromatographic steps was designed. Analogous functional properties were demonstrated for the purified recombinant PDI and the native PDI isolated from a natural source. Analysis of the inhibitory specificity showed that PDI is a potent inhibitor of selected aspartic peptidases from the A1 family and serine peptidases from the S1 family, including a relevant enzyme of insect origin. This finding supports the hypothesis that Kunitz inhibitors are involved in plant defense against herbivorous insects. The inhibitors prepared within the project will be used for analysis of the reactive centers against target peptidases by protein crystallography. (In Czech) Key words: proteolytic enzymes, activity...
Keywords: activity and inhibition of enzymes; aspartic and serine peptidases; chromatographic purification of proteins; Kunitz inhibitors; peptidase inhibitors; proteolytic enzymes; recombinant protein expression; aktivita a inhibice enzymů; aspartátové a serinové peptidasy; chromatografická purifikace proteinů; inhibitory peptidas; Kunitzovy inhibitory; proteolytické enzymy; rekombinantní exprese proteinů

Institution: Charles University Faculties (theses) (web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository.
Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/128285

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-449050


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Charles University > Charles University Faculties (theses)
Academic theses (ETDs) > Master’s theses