Název:
Použití α-N-Acetylgalactosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému
Překlad názvu:
α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators
Autoři:
Mrázek, Hynek Typ dokumentu: Rigorózní práce
Rok:
2012
Jazyk:
eng
Abstrakt: [eng][cze] α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators Introduction: Alpha-N-acetylgalactosaminidases are exoglycosidases specific for the hydrolysis of terminal α-linked N-acetylgalactosamine in various sugar chain. They occur widely in microorganisms, plants and animals, and have considerable potential in various industrial application. Stability and activity at high temperatures are important properties of α- N-acetylgalactosaminidases. A large screening study for extracellular α-N- acetylgalactosaminidase activity in a library of filamentous fungi (42 strains), led to the identification of the best constitutive producer, Aspergillus niger CCIM K2. The enzyme from Aspergillus niger has certain unique properties, and it was chosen for further investigations. Methods: Alpha-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger CCIM K2 was partially sequenced by Edman degradation and MALDI MS. Degenerated PCR primers were designed based on the obtained N-terminal and internal sequences. A gene fragment encoding a putative part of the α-N-acetylgalactosaminidase was amplified using cDNA prepared from Aspergillus niger CCIM K2. The full-length coding sequence of α-N- acetylgalactosaminidase was cloned into pYES-2CT vector and the recombinant protein was expressed in...Použití α-N-acetylgalaktosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému Úvod: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasy jsou exoglykosidasy specificky štěpící terminálně vázaný α-N-acetylgalaktosamin v různých sacharidových řetězcích neboz aminokyselin serin nebo threonin. Tyto enzymy jsou široce rozšířené, vyskytují se téměř v každém organismu. Stabilita a aktivita v extremních podmínkách je důležitá vlastnost, které se hojně využívá při mnoha průmyslových aplikací. Studium velkého množství extracelulárních α-N-acetylgalaktosaminidas izolováných z vlaknitých hub byl nalezen nejlepší producent Asperillus niger CCIM K2. Enzym izolovaný z vlaknité houby Aspergillus niger vykazoval jedinečné vlastnosti, které byly dále zkoumány. Metody: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasa izolována z A.niger byla částečně sekvenována pomocí Edmanova odbourávání a MALDI MS. Na základě zjištěných sekvencí byly navrženy degenerované oligonukleotidy. Gen kódujíci α-N-acetylgalaktosaminidasu byl amplifikovan pomocí PCR. Jako templát byla použita cDNA izolovaná z A.niger. Získaný gen byl ligován do expresního vektoru pYES-2CT a rekombinantní protein byl exprimován v kvasinkovém expresním systému Saccharomyces cerevisiae. Byly optimalizovány podmínky exprese tohoto proteinu. Protein byl...