Original title: Modifikace myších nádorových linií systémem CRISPR/Cas9 a charakterizace jejich vlastností
Translated title: Modification of murine tumor cell lines with CRISPR/Cas9 system and their characterization
Authors: Lhotáková, Karolína ; Poláková, Ingrid (advisor) ; Brábek, Jan (referee)
Document type: Master’s theses
Year: 2019
Language: cze
Abstract: [cze] [eng]
Molekuly MHCI jsou konstitutivně exprimované na všech jaderných buňkách organismu a hrají klíčovou roli v prezentaci antigenů CD8+ T lymfocytům. Nádorové buňky využívají jako jeden z nejčastějších mechanismů vyhnutí se imunitní odpovědi právě snížení exprese MHCI. To má za následek znemožnění cytotoxickým CD8+ T lymfocytům rozeznat nádorové buňky a vést proti nim imunitní odpověď. Jelikož ke snížení exprese MHCI dochází až u 90 % některých typů nádorů, je třeba mít k dispozici klinicky relevantní model nádorů s ireverzibilně sníženou expresí MHCI, na kterém by bylo možno testovat různé imunoterapeutické přístupy. Tato práce popisuje přípravu nové modelové linie nádorových buněk TC-1 s ireverzibilně sníženou expresí MHCI. Toho bylo dosaženo inaktivací B2m, jež je součástí MHCI molekuly, pomocí systému CRISPR/Cas9. Inaktivace B2m u modifikovaných buněčných linií byla ověřena průtokovou cytometrií, western blotem a sekvenací jednotlivých alel. Po této inaktivaci došlo ke zpomalení růstu nádorových buněk jak in vitro, tak in vivo. Metastatická aktivita buněk nebyla ovlivněna. Nádory vytvořené buňkami s inaktivovaným B2m nejsou citlivé k DNA imunizaci cílené proti onkoproteinu E7 z HPV16 provedené vakcínou pBSC/PADRE.E7GGG. Hlavními efektorovými buňkami v imunitě proti těmto nádorům jsou NK1.1+ buňky.... MHCI molecules are constitutively expressed in all nucleated cells and play a key role in antigen presentation to CD8+ T lymphocytes. One of the tumor immune evasion strategies is MHCI expression downregulation. This leads to an impaired recognition of tumor antigens by CD8+ T lymphocytes that are unable to start the immune response. Since the MHCI expression downregulation occurs in up to 90 % of some tumors it is neccesary to have a clinical relevant tumor model without a MHCI surface expression that would be used for testing of immunotherapeutic approaches. This thesis describes a production of new model cell lines of TC-1 tumor cells with irreversibly downregulated MHCI. That was achieved by an inactivation of B2m, which is a part of MHCI, by gene editing using CRISR/Cas9. The B2m inactivation was confirmed by flow cytometry, western blot and sanger sequencing of single alleles. The inactivation slowed down the cell growth for both in vitro and in vivo. The cell metastatic activity was not affected. The tumors established by cells without the B2m expression are not sensitive to DNA vaccine against HPV16 E7 oncoprotein by a pBSC/PADRE.E7GGG vaccine. The main effector function against these tumors possess the NK1.1+ cells. In a therapeutic vaccination experiment it was repeatedly achieved of...
Keywords: antitumor immunity; Cas9; CRISPR; DNA immunization; MHCI; tumors; β2-microglobulin; Cas9; CRISPR; DNA imunizace; MHCI; nádory; protinádorová imunita; β2-mikroglobulin

Institution: Charles University Faculties (theses) (web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository.
Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/104906

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-392929


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Charles University > Charles University Faculties (theses)
Academic theses (ETDs) > Master’s theses