|
Současné možnosti laboratorní diagnostiky pneumokokových infekcí
ČAPKOVÁ, Irena
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) může být běžnou kolonizující flórou lidského nosohltanu, ale také může být jedním z hlavních patogenů, vyvolávajících invazivní pneumokokové onemocnění. Jeho diagnostika je založena na přímém průkazu pomocí metod mikroskopie, kultivace, identifikace a bezkultivačního průkazu antigenu či deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Úvodní část práce je věnována popisu rodu Streptococcus, včetně druhu S. pneumoniae. Je popsána morfologie, fyziologie, antigenní struktura, patogeneze i patogenita tohoto bakteriálního rodu a druhu i teoretický popis jednotlivých metod laboratorní diagnostiky. V metodice jsou popsány postupy identifikačních metod, tak jak byly použity k diagnostice S. pneumoniae v Laboratoři lékařské mikrobiologie, Pracoviště bakteriologie Nemocnice České Budějovice a.s. Popsány jsou kultivace biologických vzorků, z kterých byl S. pneumoniae izolován, ale také jednotlivé identifikační testy, které umožňují rozlišit S. pneumoniae od ostatních viridujících streptokoků. K diagnostice byly využity dva základní, běžně užívané identifikační testy test citlivosti k optochinu a test rozpustnosti ve žluči-deoxycholát sodný. Test rozpustnosti ve žluči účinkem deoxycholátu sodného je základním testem v diagnostice S. pneumoniae. Ze 127 testovaných kmenů, získaných kultivačním průkazem s pozitivním testem rozpustnosti ve žluči, bylo v testu citlivosti k optochinu pozitivních 114 testovaných kmenů. Test citlivosti k optochinu měl úspěšnost 89,9%. Metodou hmotnostní spektrometrie Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI TOF MS) byly testovány pouze 4 kmeny primárně určené jako viridující streptokoky. Tuto specifickou, rychlou a přesnou metodu nelze k identifikaci S. pneumoniae zcela využít, díky velmi blízkému genotypu se Streptococcus oralis/mitis. K průkazu antigenu S. pneumoniae byly použity a popsány dva testy imonochromatografický test a latex aglutinační reakce. Imunochromatografickým testem byl prokázán 15x antigen z moči a likvoru z celkem vyšetřovaných 266 vzorků a latex aglutinační reakcí se podařilo prokázat 7x antigen S. pneumoniae v hemokultuře a likvoru. Tyto dvě metody jsou vysoce specifické. Podávají rychlou informaci o přítomnosti antigenu S. pneumoniae ve vyšetřovaném vzorku a tedy o možnosti probíhající závažné pneumokokové infekce. Dalším vysoce specifickým testem k diagnostice závažných invazivních pneumokokových onemocnění je průkaz DNA metodou PCR, který byl úspěšný u 5 vzorků likvoru, vyšetřovaných současně i v Laboratoři molekulární biologie a genetiky, Nemocnice České Budějovice a.s.
|
|
Lymfom z buněk pláště, genová exprese v patogeneze onemocnění
Břízová, Helena
Souhrn Molekulárním znakem lymfomu z buněk pláště (MCL) je přítomnost charakteristické translokace t(11;14), v jejímž důsledku dochází k transkripční aktivaci genu pro cyklin D1. Overexprese cyklinu D1 jako klíčové molekuly regulace buněčného cyklu pak poskytuje buňkám proliferační výhodu, která se uplatňuje v patogenezi MCL. Proliferační aktivita buněk je pak významným a prvním biologickým faktorem v predikci prognózy pacientů s MCL. Zavedli a vypracovali jsme optimální postup kvantitativní analýzy exprese cyklinu D1 ve vzorcích lymfomů pomocí PCR v reálném čase. Overexpresi cyklinu D1 jsme detekovali u 97% vzorků MCL. Zavedená metodika poskytla podporu diferenciální diagnózy MCL s vysokou spolehlivostí, včetně diagnostiky lymfomů extranodální lokalizace. Měření hladiny exprese mRNA cyklinu D1 navíc poskytlo nástroj molekulárního studia klíčové molekuly v patogenezi onemocnění MCL. Prokázali jsme přímý vztah mezi t(11;14), overexpresí mRNA cyklinu D1 a patologickou syntézou proteinu cyklinu D1 v buňkách MCL. Hladina mRNA cyklinu D1 dále korelovala s hladinou mRNA proliferačních markerů, což svědčí pro kvantitativní řízení buněčného cyklu prostřednictvím regulované hladiny cyklinu D1 určující míru buněčné proliferace a naznačuje patogenní dráhu MCL: t(11;14) → overexprese mRNA cyklinu D1 → tvorba proteinu...
|
|
Význam aberací MLL genu u nemocných s akutní myeloidní leukemií
Šárová, Iveta
Aberace chromozomu 11 postihují u akutní myeloidní leukemie (AML), konkrétně u subtypu AML-M5, nejčastěji oblast 11q23. Pomocí molekulárních studií translokací 11q23.3 byl identifikován gen MLL (myeloid/lymphoid leukemia) účastnící se těchto přestaveb. Gen MLL kóduje transkripční faktor regulující expresi specifických HOX (homeobox) genů a je důležitý pro normální průběh ontogeneze a vývoj krevních buněk. Chromozomové aberace MLL genu se vyskytují u 5 - 10 % nemocných s AML a jsou velmi variabilní. Do roku 2008 bylo popsáno více než 70 různých translokací tohoto genu. Alterace MLL genu bývají často spojovány s agresivním typem onemocnění a tedy i špatnou prognózou pro nemocného. Jejich detekce je proto nezbytná pro volbu léčebné terapie. V této práci uvádím analýzu abnormalit MLL genu detekovaných v buňkách kostní dřeně u 66 nemocných s nově diagnostikovanou AML pomocí metod klasické cytogenetiky a fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s komerčně dodávanou sondou pro MLL gen (Abbott VYSIS). Aberace MLL genu byla prokázána u 9 (13,6%) nemocných: 5x translokace (7,6%), 3x mnohonásobná amplifikace (4,5%) a 1x duplikace MLL genu (1,5%). Výsledky FISH analýzy byly upřesněny metodami mnohobarevné FISH (mFISH) a mnohobarevného pruhování (mBAND). V této studii také uvádím nový možný partnerský gen - gen...
|
|
Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy
Suldovská, Sabina ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Černá, Leona (oponent)
F1FO-ATPsyntáza je klíčovým enzymem buněčného energetického metabolismu. Její případný deficit může být způsoben mutacemi ve dvou strukturních genech MT-ATP6 a MT- ATP8 v mitochondriální DNA či v jaderných genech ATPAF2 a TMEM70 kódující faktory pro biogenezi enzymu a strukturním genu ATP5E. Deficit F1FO-ATPsyntázy vede k rozvoji velmi závažného fenotypu postihující orgány s vysokými energetickými nároky s nástupem v novorozeneckém věku a nepříznivou prognózou. Mutace v uvedených genech navíc nezpůsobují pouze kvalitativní (mutace ve strukturních podjednotkách enzymu) či kvantitativní (mutace v genech pro faktory biogeneze enzymu) defekty, ale také jejich kombinace. Při studiu molekulární podstaty mitochondriálních onemocnění včetně deficitu F1FO-ATPsyntázy se využívá široká škála biochemických i molekulárně-genetických metod pro stanovení správné diagnózy, která je nezbytná pro včasné zahájení symptomatické léčby a genetické poradenství v postižených rodinách. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat deficit F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z linií kultivovaných buněk stanovením oligomycin-sensitivní ATP- hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy, enzymových aktivit komplexů dýchacího řetězce a sledováním změn v množství jednotlivých vybraných podjednotek a celého komplexu F1FO-...
|
|
Diferenciální diagnostika vřetenobuněčných lézí trávicího traktu
Daum, Ondřej ; Hes, Ondřej (vedoucí práce) ; Mandys, Václav (oponent) ; Ehrmann, Jiří (oponent) ; Zámečník, Josef (oponent)
MUDr. Ondřej Daum DIFERENCIÁLNÍ DIAGNOSTIKA VŘETENOBUNĚČNÝCH LÉZÍ TRÁVICÍHO TRAKTU DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF SPINDLE CELL LESIONS OF THE DIGESTIVE TRACT UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE LÉKAŘSKÁ FAKULTA V PLZNI Šiklův ústav patologie FN a LF UK Plzeň, 2006 1 Dizertační práce byla zpracována v rámci kombinované formy postgraduálního studia na Šiklově ústavu patologie FN a LF UK v Plzni v letech 2004-2006. Doktorand: MUDr. Ondřej Daum Školitel: Doc. MUDr. Ondřej Hes, PhD. docent Lékařské fakulty UK, Šiklův ústav patologie FN a LF UK v Plzni Oponenti: Prof. MUDr. Václav Mandys, CSc. přednosta Ústavu patologie FN Královské Vinohrady a 3. LF UK v Praze Doc. MUDr. Jiří Ehrmann, PhD. docent Lékařské fakulty UP, Ústav patologie FN a LF UP v Olomouci Doc. MUDr. Josef K. Zámečník, PhD. docent Lékařské fakulty UK, Ústav patologie FN Motol a 2. LF UK v Praze Stanoviska k dizertaci vypracovala Lékařská fakulta UK v Plzni. Autoreferát byl odeslán dne .......................................................... Obhajoba se koná dne .................................... 2007 v ....................... hod. před komisí pro obhajoby doktorských dizertací v oboru patologická anatomie v...................................................................................................... S dizertační prací je možné se seznámit na...
|
|
Laboratorní diagnostika mykobakterií se zaměřením na bakteriologický průkaz
VELKOVÁ, Martina
Laboratorní metody hrají důležitou roli v diagnostice onemocnění. I když jsou v současné době k dispozici rychlé molekulárně - genetické metody a metody založené na imunitní odpovědi organismu, základní vyšetřovací metodou přímého průkazu stále zůstává mikroskopický a kultivační průkaz. Mikroskopie je základní metodou pro většinu patologických vzorků, především pro sputum. Citlivost této metody není vysoká, přesto je důležitá. Umožňuje rychle odhalit rozsáhlá klinicky i epidemiologicky závažná onemocnění. U kultivačního průkazu se za ?zlatý standard? považuje kultivace na pevných vaječných půdách. V současné době bývá doplňována kultivací v automatickém detekčním systému, který urychluje dobu detekce. Tato práce byla prováděna v období 1.1. - 6.6. 2013 v Nemocnici Č. Budějovice a.s. v Laboratoři lékařské mikrobiologie, Pracoviště bakteriologie. Do studie bylo celkem zahrnuto 400 sput, které byly zpracovány a vyšetřovány. Cílem bylo ověřit a porovnat účinnost dekontaminačních metod za použití HCl a NALC. Zároveň byla sledována výtěžnost a doba detekce v klasické kultivaci a v automatickém detekčním systému BACTECTM MGITTM 960. Automatický systém využívá neradiometrickou fluorescenční technologii. Kultivace probíhá v tekutém Middlebrook 7H9 médiu s přídavkem antimikrobiálních látek (polymyxin B, amfotericin B, kyselina nalidixová, trimetoprim, azlocilin). U klasické kultivace byly použity pevné vaječné půdy: Löwenstein-Jensenova a půda podle Ogawy. Jednotlivé výsledky pak ukazují, že u metody s HCl byla kontaminace celkem u 1 % vzorků. Pro jednotlivé metody pak v 5 % v BACTECTM MGITTM 960 a 4 % v klasické kultivaci. Ve srovnání u metody s NALC byla kontaminace celkem u 21 % vzorků a z toho pro jednotlivé metody 26 % v BACTECTM MGITTM 960 a 50 % v klasické kultivaci. Z těchto výsledků je tedy patrné, že metoda s NALC má nižší účinnost, podíl kontaminace oproti metodě s HCL se zvýšil o 20 %. Dekontaminační metoda s NALC je doporučena výrobcem pro BACTECTM MGITTM 960. Byla ale shledána nevyhovující a nebylo v ní možné nadále pokračovat. Porovnáním výtěžnosti a doby detekce izolovaných kmenů u jednotlivých metod bylo prokázáno, že BACTECTM MGITTM 960 vykazuje větší citlivost než klasická kultivace, neboť ze 17 celkem izolovaných kmenů BACTECTM MGITTM 960 zachytil 15 oproti 10 izolovaným kmenům v klasické kultivaci. Patrný je i výrazně kratší čas detekce pozitivních vzorků. Průměrný čas detekce u BACTECTM MGITTM 960 byl 16,2 dní, zatímco u klasické kultivace 31 dní. Potvrdilo se, že systém BACTECTM MGITTM 960 dosahuje lepších výsledků, ale optimalizace je dosaženo kombinováním obou používaných metod. Ze zpracovaných statistických údajů za období 2010 - 2012 je patrný pokles, ale k výraznému snížení nedochází. Znatelný je pouze pokles Mycobacterium bovis BCG, což se dá vysvětlit tím, že očkování proti tuberkulóze není již od roku 2011 prováděno plošně, ale podle nové platné legislativy pouze u rizikových skupin. Zajímavou skutečností je i to, že každoročně je v laboratoři nejvyšší záchyt ve věkové skupině nad 60 let.
|
|
Laboratorní diagnostika poruch fagocytózy
POLÍVKOVÁ, Ivona
Fagocytóza je jeden z nejstarších dějů, podobný pohlcování částic amébami, a patří mezi základní obranné mechanismy imunitního systému při postižení oraganismu infekcí. Porucha fagocytózy se klinicky manifestuje pod obrazem imunitní nedostatečnosti a může být příčinou velmi závažných onemocnění, jejichž neléčení ústí ve smrt postiženého člověka. Je to proces, při kterém jsou specializované buňky (makrofágy, dendritické buňky, neutrofilní granulocyty a ostatní fagocytární myeloidní buňky) schopné pohltit cílové částice, především mikroorganismy, odumřelé buňky a cizí tělesa. Tento proces je klíčový pro udržení homeostázy, kdy dochází po pohlcení mikroorganismů k aktivaci adaptivní imunitní odpovědi, odstranění apoptotických a jinak změněných buněk a nastartování opravných mechanismů u poškozené tkáně. Jedná se o složitý proces, který můžeme rozdělit na několik fází: aktivní pohyb fagocytů do místa zánětu, adherenci, ingesci a intracelulární degradaci, která vede k zabíjení patogenů pomocí mnoha mechanismů. Ty mohou být jednak na kyslíku nezávislé, kde jsou antimikrobiální látky uložené v azurofilních granulích uvolňovány do fagolysozomu, anebo na kyslíku závislé, tzv. oxidační (respirační) vzplanutí, vedoucí k tvorbě biologicky aktivních kyslíkových mediátorů a molekul se značným oxidačním potenciálem. Defekty postihující fagocytární systém jsou převážně v poruchách počtu či ve funkci neutrofilních granulocytů. Poruchy fagocytózy se projevují infekcemi, způsobenými zejména stafylokoky, enterobakteriemi či plísněmi. K funkčním poruchám fagocytózy patří např. LAD I a LAD II syndrom. Dalšími poruchami funkce fagocytózy je defekt v enzymatickém systému NADPH oxidázy, která je stěžejnějším enzymem baktericidního mechanismu fagocytů. Tento defekt je příčinou vzácného závažného vrozeného onemocnění, chronické granulomatózní choroby. Autosomálně recesivní porucha enzymu myeloperoxidáza, který částečně nebo úplně chybí v azurofilních granulích neutrofilů a monocytů, je další a častější poruchou fagocytózy. K odhalení těchto vzácných a závažných poruch obrany organismu máme celou řadu laboratorních metod, od hodnocení počtu neutrofilů v krevním obraze, po stanovení jejich respirační aktivity pomocí průtokové cytometrie, které jsem v této práci použila. Jedná se o tzv. Burst test, kde se kvantitativně hodnotí respirační vzplanutí granulocytů v heparinizované krvi měřením na průtokovém cytometru. Princip testu spočívá ve využití oxidační redukce dihydrorhodaminu 123 na zeleně fluoreskující rhodamin 123 pomocí peroxidu, hydroxylových radikálů a superoxidových aniontů, vznikajících při aktivaci respiračního vzplanutí Respirační vzplanutí je jednou z vlastností fagocytárních buněk a je charakterizováno vícestupňovou aktivací NADPH oxidázy, která katalyzuje elektronové snížení molekulárního kyslíku na superoxid. Hraje velmi důležitou roli imunitního systému v obraně organismu, umožňuje usmrtit a degradovat fagocytárním buňkám pohlcené částice a bakterie. V období let 2009 ? 2012 jsem vyhodnotila výsledky 611 pacientů, u kterých byl proveden test respiračního vzplanutí na základě požadavku ošetřujícího lékaře. Z celkového počtu vyšetřených pacientů byl jen u 2 pacientů zaznamenán snížený SI za současného výrazného snížení procenta aktivovaných granulocytů. Oba tyto parametry snížené procento aktivovaných granulocytů stimulovaných PMA a E. coli a nízký SI ukazoval na možnou závažnou poruchu fagocytózy. V následných testech byl zjištěn defekt enzymu, jenž v rámci imunodeficiencí fagocytózy bývá častější, a který se v Burst testu projeví právě výrazným snížením SI i procenta aktivovaných granulocytů. Z výsledků je patrné, že závažné primární defekty v mechanizmu fagocytózy jsou velmi vzácné a jejich zachycení dochází většinou již v dětském věku, jelikož se jedná o primární imunodeficienci. Proto má toto vyšetření stěžejní význam u dětí s podezřením na imunodeficienci.
|
|
Současné možnosti laboratorní diagnostiky stafylokokových infekcí
CHRTOVÁ, Lucie
Laboratorní diagnostika stafylokokových infekcí je založena na přímém průkazu, tj. na mikroskopii a kultivaci, případně průkazu bakteriální DNA. Cílem této práce je posouzení současné možnosti laboratorní diagnostiky infekcí způsobených koaguláza - negativními stafylokoky a porovnání jednotlivých metod používaných k identifikaci v rutinní laboratorní praxi. Úvodní část práce je věnována popsání rodu Staphylococcus, jeho odlišení od rodů Micrococcus a Peptococcus. Následně pak rozdělení rodu Staphylococcus na základě schopnosti enzymaticky koagulovat plazmu do dvou hlavních skupin (stafylokoků koaguláza - pozitivních a koaguláza - negativních). U těchto dvou hlavních skupin je popsána jejich morfologie, kultivace, antigenní struktura, faktory virulence, patogeneze a laboratorní diagnostika. V metodické části je zmíněná preanalytická a analytická fáze vyšetření. Preanalytická část je zaměřená na obecné zásady odběru a transportu materiálu na mikrobiologické vyšetření a samotný odběr materiálu. Metodická část byla prováděna v Laboratoři lékařské mikrobiologie na Pracovišti bakteriologie v Nemocnici České Budějovice a.s. V této části práce je popsáno rozlišení stafylokoků na základě koagulázového testu latexovou aglutinací (PROLEXTM STAPH LATEX KIT) a následně druhová identifikace 52 kmenů stafylokoků koaguláza - negativních, izolovaných z centrálních žilních katétrů, hemokultur a jiných klinicky závažných materiálů. Druhová identifikace všech 52 kmenů stafylokoků koaguláza - negativních byla provedena biochemickou identifikací testem STAPHYtest 16 a paralelně hmotnostní spektrometrií - technologie MALDI-TOF systémem VITEK MSTM. Těmito metodami byly kmeny identifikovány s úspěšností 96,2 % u metody hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF a s úspěšností 67,3 % u biochemické identifikace STAPHYtest 16. Nejčastěji byl identifikován druh Staphylococcus epidermidis (64 %), následně Staphylococcus hominis ssp. hominis (10 %), Staphylococcus capitis (6 %), Staphylococcus warneri (6 %), Staphylococcus lungdunensis (4 %), Staphylococcus haemolyticus (4 %), Staphylococcus hominis (4 %), Staphylococcus caprae (2 %). V porovnání obou metod je hmotnostní spektrometrie spolehlivější, rychlejší a jednodušší metodou vhodnou do rutinní laboratorní praxe.
|
|
Evoluce způsobů určování pohlaví a genomů u šupinatých plazů (Reptilia: Squamata)
Pokorná, Martina ; Kratochvíl, Lukáš (vedoucí práce) ; Marec, František (oponent) ; Vyskot, Boris (oponent)
Evoluce způsobů určování pohlaví a genomů u šupinatých plazů (Reptilia: Squamata) Martina Pokorná disertační práce Abstrakt Disertační práce se zabývá evolucí způsobů určování pohlaví a genomů u šupinatých plazů. Jejím základem jsou tři publikované práce a dva rukopisy. Evoluce pohlavně determinačních mechanismů, pohlavních chromosomů a genomů a jejich uspořádání byla studována na širší fylogenetické úrovni všech šupinatých plazů se začleněním dalších linií plazů a také na menší škále jako podrobné srovnání uvnitř vybraných linií. Problematika byla studována klasickými cytogenetickými metodami a metodami molekulární cytogenetiky, zejména s použitím fluorescenční in situ hybridizace na různých úrovních. Výsledky byly interpretovány v rámci fylogenetických postupů. Práce přispívá k hlubšímu porozumění principů určování pohlaví a evoluce tohoto fenoménu nejen u šupinatých plazů, ale i u amniotických obratlovců. Na základě výsledků získaných při řešení problematiky je možné konstatovat, že pohlavní chromosomy vznikaly v evoluci v jednotlivých skupinách amniotických obratlovců nezávisle. Tento vznik je v některých případech následován akumulací mikrosatelitových sekvencí na pohlavních chromosomech, jejichž charakter však není společný pro pohlavní chromosomy u různých fylogenetických linií. Uspořádání genomů...
|
|
Studium aneuploidie v gametách a embryích
Diblík, Jan ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Forejt, Julius (oponent) ; Rubeš, Jiří (oponent)
Doktorská disertační práce se zabývá vypracováním a zavedením zdokonalených molekulárně cytogenetických vyšetření pro reprodukční genetiku. Zahrnuje metody klinické přímo užívané ke zlepšení diagnostiky a terapie pacientů z neplodných párů i metody experimentální, které pokud se jejich přínos prokáže, mohou být základem nových diagnostických postupů. Práce se soustřeďuje na studium aneuploidií, neboť představují závažnou komplikaci lidské reprodukce a jsou zásadním problémem léčby metodami asistované reprodukce. Cíle Z klinického hlediska bylo hlavním cílem práce bylo zavedení vyšetření chromosomů spermií, polárních tělísek a blastomer pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pro prefertilizační a preimplantačního diagnostiku aneuploidií Hlavním výzkumným cílem bylo provedení studie lokalizace chromosomů v jádrech blastomer odebraných pro preimplantační vyšetření po mimotělním oplození. Záměrem bylo zjistit, zda pro polohu chromosomů z hlediska umístění ve středu nebo na periferii jádra platí u blastomer podobná pravidla jako u jiných buněčných typů v pozdějších stádiích vývoje a zda je poloha chromosomů ovlivněna aneuploidií. Dále jsme si dali za cíl pátrat pro periferní lokalizaci chromosomu X v buňkách s více kopiemi chromosomu X. Ta by mohla být projevem inaktivace chromosomu X, která dle...
|
host ::
