|
|
Využití kultivačních desek pro tkáňové kultury k testování podmínek exprese rekombinantních proteinů v buněčné linii HEK293
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Efektivní produkci rekombinantních proteinů (r-protein) předchází testování jejich exprese v malém objemu. Práce byla proto zaměřena na optimalizaci exprese r-proteinů ve 12 jamkových deskách. Optimalizace desek zahrnovala testování vhodné rychlosti třepání, produkčního a transfekčního objemu. Srovnávala jsem stávající testovací nádoby, 50 ml centrifugační tuby, s nově testovanými deskami jako možnou náhradou za nevyhovující tuby. Dalším sledovaným parametrem bylo porovnat nově testované desky s výrobními čtyřhrannými láhvemi s cílem, aby exprese r-proteinu v deskách co nejvíce odpovídala expresi v láhvích. Byl sledován vliv CO2 na počet živých buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP v různých kultivačních nádobách (desky, tuby, láhve) a doplňkově také pH netransfekované buněčné kultury HEK 293 v průběhu čtyřdenní kultivace. Na základě výsledků a jejich statistického zpracování byly stanoveny pro 12-jamkové desky optimální otáčky 230 rpm a jako vhodný produkční a transfekční objem byl určen 2 a 0,5 ml. Po vyhodnocení proměnných a srovnání kultivací v jednotlivých nádobách, bylo možné tuby nahradit deskami. Statisticky byl prokázán významný vliv CO2 na počet buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP a pH buněčné kultury HEK 293 v kultivačních nádobách. Nejsilnější exprese r-proteinu bylo dosaženo v prostředí s CO2. Výsledky této práce umožňují aplikovat 12-jamkové kultivační desky pro testování exprese r proteinu v malém objemu v prostředí s CO2. Na základě zjištěných údajů může exprese r proteinu probíhající v deskách v prostředí s CO2 napodobit expresi ve výrobní láhvi bez přítomnosti CO2.
|
|
|
Transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů
Čutová, Michaela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Diplomová práce studuje problematiku transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů. V teoretické části jsou obsaženy poznatky o vzniku rekombinantních molekul DNA, použití expresních vektorů, přenosu DNA a následné detekci rekombinantního proteinu. Experimentální část byla zaměřena na nalezení vhodné transfekční metody pomocí polyethyleniminu, kdy hostitelskými buňkami byly buňky 293HEK/EBNA. V první části byl zvolen nejúčinnější plazmid – pCEP4/SEAP. Dále byly zkoumány tři transfekční metody: Muller (2005), Durocher et al. (2007) a Backliwal et al. (2008). Nejvyšší dosažené exprese SEAP bylo dosaženo metodou Backliwal et al. (2008).
|
|
|
Cathepsin L of Sphaerospora molnari - localisation, function and diagnostic tools
NECHVILE, Rudolf Lukas
The aim of this thesis was to develop diagnostic and quantitative assays/tools based on western blotting, confocal microscopy and immunogold electron microscopy, as well as flow cytometry, to determine the localisation and potential function of the highly expressed cathepsin L of the myxozoan parasite Sphaerospora molnari (SmolCL) in its fish host, the common carp. Furthermore, a recombinant SmolCL was used in a vaccine trial to estimate its potential for raising antibodies in carp and test their immunoprotective potential towards S. molnari. This thesis provides new methodological tools for research and allows a greater understanding of myxozoan parasite-fish host interactions based on proteolytic enzymes.
|
|
|
Preparation of antibodies to determine the association of mitoribosomal complexes with mitochondrial membrane
ZELLNER, Laura
The assembly pathways of mitoribosomes, descendants of bacterial ancestors producing proteins encoded by vestigial mitochondrial genomes, remains largely unknown. To shed light on structural features of a precursor of the highly divergent small mitoribosomal subunits (mtSSU) from Trypanosoma brucei, called mtSSU assemblosome, recently characterized by cryoEM, we raised antibodies against two assembly factors present in the complex and against two subunits of the mature mtSSU. We used the antibodies in pilot experiments to determine whether the assemblosome associates with the inner mitochondrial membrane.
|
|
| |
|
|
Metody dekontaminace rekombinantních proteinů od bakteriálního lipopolysacharidu
CHARVÁTOVÁ, Lucie
V této práci byly použity tři metody dekontaminace rekombinantních proteinů od bakteriálního lipopolysacharidu s cílem zjistit, jaká metoda je nejefektivnější. Metody byly založené na dvoufázové extrakci na bázi detergentu a afinitní chromatografii. Efektivita nejúčinnější metody byla dále měřena za použití různých rekombinantních proteinů a při několika různých koncentracích proteinů. Tři různé testy, dva chromogenní a jeden fluorogenní, byly použity pro měření koncentrace endotoxinu ve vzorcích a byla vybrána nejpřesnější metoda pro měření koncentrace endotoxinu ve vzorcích.
|
|
|
Preparation of mutant variants of Kingella kingae RtxA cytotoxin for membrane topology research
Lichvárová, Michaela ; Osičková, Adriana (vedoucí práce) ; Malý, Petr (oponent)
Kingella kingae je fakultativně anaerobní, β-hemolytická, gramnegativní bakterie. Bylo prokázano, že K. kingae je důležitou příčinou invazivních infekcí u malých dětí zejména ve věku od 6 do 36 měsíců. Nejčastější onemocnění způsobená bakterií K. kingae jsou septická artritida, osteomyelitida, bakteriémie a infekční endokarditida. Klíčovým faktorem virulence K. kingae je sekretovaný RtxA toxin, který patří do skupiny RTX toxinů (z angl. Repeats in ToXin). Ty se na základě buněčné specifity jejich účinku dělí do dvou kategorií, a to na hemolyziny a leukotoxiny. Široká specifita RtxA toxinu naznačuje, že daný toxin patří mezi hemolyziny. Molekuly RtxA toxinu se vkládají do membrány hostitelské buňky a vytvoří v ní póry, které jsou schopny propouštět ionty, čimž dojde k porušení iontové rovnováhy nitrobuněčného prostředí a k případné lýze buňky. Cílem předkládané bakalářské práce bylo připravit mutantní varianty cytotoxinu RtxA s lysinovými substitucemi v doméně tvořící póry pro budoucí studium membránové topologie daného toxinu s využitím metody navázaní biotinu na aminokyselinový zbytek lysinu. Pro studium topologie RtxA toxinu v membráně hostitelské buňky musí být daný toxin schopen vkládat se do buněčné membrány. Proto dalším cílem bylo stanovení biologické aktivity mutantních variant RtxA toxinu...
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
host ::
RSS.