|
|
Odhalení molekulárních mechanismů opravy abazického meziřetězcového spojení DNA
Hušková, Andrea ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
3 Abstrakt DNA jako primární nositelka genetické informace zaručuje organismům žít, růst, rozvíjet se a množit. Tato nejpodstatnější molekula v buňce však podléhá každou chvíli rozličným poškozením. Pokud není opraveno, buňka a organismus nakonec podlehne nevyhnutelné destrukci. Jedno z nejzávažnějších poškození je meziřetězcové kovalentní spojení DNA vycházející z abazického místa (Ap-ICL, z angl. Abasic site interstrand crosslink). Ap-ICL se tvoří spontánně z abazického místa kovalentní vazbou s adeninem na opačném řetězci. Nedostatek informací o opravných mechanismech, vlivu lokální sekvence a jeho stabilitě vede k otázkám ohledně osudu, toxicitě a výskytu těchto lézí v buňkách. Evoluce vytvořila několik mechanismů jak tato a další jiná poškození opravit a zajistit organismu jeho přetrvání. Nedávno objevená dráha známa pro opravu Ap-ICL dostala název po glykosylase zodpovědné za odstranění Ap-ICL. DNA glykosylasa NEIL3 je k Ap-ICL přivolána ubiquitylací DNA helikasy, která je součástí komplexu zodpovědného za replikaci DNA. Glykosylasa NEIL3 obsahuje několik domén s motivem zinkového prstu, které se vážou k poškozené DNA a zajišťují její katalytickou funkci. Momentálně není znám molekulární mechanismus opravného procesu glykosylasy NEIL3. S cílem odpovědět na zmíněné neznámé byla v předložené práci...
|
|
|
Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
Škerle, Jan
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou v přírodě široce rozšířeny a vyskytují se ve všech doménách života. Podílejí se na mnoha důležitých procesech, jako například kontrola kvality membránových proteinů nebo mitochondriální dynamika. Jejich aktivita souvisí s nemocemi jako Parkinsonova nemoc nebo rakovina. Proto se rhomboidy jeví jako potenciální terapeutické cíle. V této práci jsme se snažili objasnit detailní mechanismus fungování modelové proteasy GlpG z E. coli. Zaměřili jsme se i na mechanismus rhomboidu RHBDL2, což je jeden ze čtyř eukaryotických rhomboidů, jejichž funkce není příliš prostudována. Pro pochopení vazby mezi substrátem a enzymem jsme připravili řadu nových peptidyl-chlormethylketonových inhibitorů odvozených od proteinu TatA, což je substrát rhomboidu v P. stuartii. Díky krystalové struktuře komplexů GlpG s těmito inhibitory jsme prozkoumali vazebná místa substrátu S1 až S4, což nám umožnilo objasnit strukturní podstatu substrátové specifity enzymu. Ukázali jsme, že rychlost štěpení substrátu může být významně ovlivněna modifikací sekvence substrátu na pozicích P1 až P5. Na základě těchto pozorování jsme vyvinuli fluorogenní transmembránový peptidový substrát rhomboidových proteas, který je použitelný jak v detergentu, tak v liposomech, a je vhodný pro testování s...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
Škerle, Jan ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou v přírodě široce rozšířeny a vyskytují se ve všech doménách života. Podílejí se na mnoha důležitých procesech, jako například kontrola kvality membránových proteinů nebo mitochondriální dynamika. Jejich aktivita souvisí s nemocemi jako Parkinsonova nemoc nebo rakovina. Proto se rhomboidy jeví jako potenciální terapeutické cíle. V této práci jsme se snažili objasnit detailní mechanismus fungování modelové proteasy GlpG z E. coli. Zaměřili jsme se i na mechanismus rhomboidu RHBDL2, což je jeden ze čtyř eukaryotických rhomboidů, jejichž funkce není příliš prostudována. Pro pochopení vazby mezi substrátem a enzymem jsme připravili řadu nových peptidyl-chlormethylketonových inhibitorů odvozených od proteinu TatA, což je substrát rhomboidu v P. stuartii. Díky krystalové struktuře komplexů GlpG s těmito inhibitory jsme prozkoumali vazebná místa substrátu S1 až S4, což nám umožnilo objasnit strukturní podstatu substrátové specifity enzymu. Ukázali jsme, že rychlost štěpení substrátu může být významně ovlivněna modifikací sekvence substrátu na pozicích P1 až P5. Na základě těchto pozorování jsme vyvinuli fluorogenní transmembránový peptidový substrát rhomboidových proteas, který je použitelný jak v detergentu, tak v liposomech, a je vhodný pro testování s...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav ; Ledvinová, Jana (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Holčapek, Michal (oponent)
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
host ::
RSS.