|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3
Dudová, Radka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Dudová Radka Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3 Purifikace vektoru pOTB7 s kódovou sekvencí aldo-ketoreduktasy 1C3 ( AKR1C3 ) v buňkách Escherichia coli byla provedena metodou alkalické lýze. Kódová sekvence byla následně amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí. Správnost výsledku provedeného kroku byla prokázána ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a restrikční analýzou s restrikční endonukleasou PvuII. V druhém kroku byla kódová sekvence ligována do vektoru Topo 2.1, který byl transformován do kompetentních buněk E. coli. Buňky byly namnoženy a vektor Topo 2.1 s vloženou kódovou sekvencí byl získán metodou alkalické lýze. Výsledek byl ověřen porovnáním velikosti vektoru Topo 2.1 bez vloženého insertu a vektoru Topo 2.1 s kódovou sekvencí na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou s restrikční endonukleasou HindIII. Kódová sekvence byla ověřena metodou sekvenace. Dále byla provedena subklonace kódové sekvence z vektoru Topo 2.1 do expresního vektoru pET-15b. Úspěšnost subklonace byla ověřena porovnáním velikosti prázdného pET-15b a vektoru s vloženou sekvencí. V posledním kroku byl vytvořen...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1
Lundová, Tereza ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Lundová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1 Aldosareduktasa (EC 1.1.1.21) AKR1B1 je jedním ze 13 lidských enzymů z AKR nadrodiny. Všechny lidské AKR jsou cytosolické a NADP(H) dependentní. AKR1B1 hraje důležitou roli v metabolismu endogenních i exogenních látek. Hlavním endogenním substrátem je glukosa. Její redukce na sorbitol je důsledně spojena se sekundárními diabetickými komplikacemi. Z xenobiotik je metabolizován pomocí AKR1B1 daunorubicin, protinádorové léčivo ze skupiny antracyklinů, které je redukováno na daunorubicinol. Tento metabolit je méně aktivní než původní léčivo a je příčinou antracyklinem způsobené kardiotoxicity. V současnosti je mnoho projektů zaměřených na zkoumání AKR1B1 jako cílového enzymu a hledání specifických inhibitorů. Rekombinantní protein byl připraven v E. coli společně s pET-28b(+) expresním vektorem. Nejprve byla izolována z E. coli cDNA pro AKR1B1 v pOTB7. Kódová sekvence AKR1B1 byla namnožena pomocí PCR. PCR byla provedena s Phusion Hot Start II polymerasou a párem forward a reverse primerů, které obsahují restrikční místa pro NdeI a XhoI. Jako vektor byl použit plasmid pET-28b(+)....
|
|
|
Inhibiční studie lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Laštovková, Linda ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Linda Laštovková Supervisor: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of thesis: Inhibition study of human membrane-bound carbonyl reductase. Carbonyl reductases are an important group of enzymes that participate in metabolism of both endogenous substances also xenobiotics. Potential anticancer drug oracin is one of such xenobiotics that is metabolised by various carbonyl reductases to two enantiomers of dihydrooracin. The new human microsomal carbonyl reductase also takes part in biotransformation of oracin. This enzyme was recently purified on Department of biochemical sciences (Faculty of Pharmacy in Hradec Králové). The aim of this study was to find some inhibitors of the new enzyme and distinguish it in terms of inhibitors from another microsomal carbonyl reductase 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1. Flavonoids are substances produced by plants, they have a different both positive and also negative effect on human organism. One of such effect is inhibition effect on diverse enzymes. Carbonyl reductases also fall in this group. It has been described inhibitory effect of different flavonoids on carbonyl reductases. Inhibition study of the new human micorosomal carbonylreductase was...
|
|
|
Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Rudolf Andrýs Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce: VÝVOJ A APLIKACE AFINITNÍHO NOSIČE PRO IZOLACI LIDSKÝCH KARBONYL-REDUKUJÍCÍCH ENZYMŮ Již po několik tisíciletí tvoří základ lidské medicíny malé bioaktivní molekuly, které byly podávány ve formě rostlinných extraktů nebo syntetický připravených sloučenin. Jejich využití v moderní lékařské vědě ovšem není možné bez detailního porozumění jejich biochemických účinků a identifikace jejich molekulárních cílů. Metody chemické proteomiky, založené na specifické interakci mezi bioaktivní látkou a cílovou molekulou, patří v současné době k nejpoužívanějším technikám při identifikaci molekulárních cílů malých molekul. Oproti klasickým biochemickým metodám (např. 2D elektroforéza) se jedná o citlivé a především velmi selektivní techniky, díky kterým lze z komplexních biologických vzorků úspěšně identifikovat i biomolekuly, které se přirozeně vyskytují jen ve velmi malých koncentracích. Takovými biomolekulami jsou i karbonyl-redukující enzymy, které představují fyziologicky důležitou skupinu proteinů, jelikož se podílí na metabolismu řady endogenních (např. prostaglandiny, steroidní hormony) i xenobiotických (např....
|
|
|
The impact of inflammation on muscarinic receptor subtypes expression - Immunohistochemical examination of lacrimal and salivary glands of rat and human
Székelyová, Anita ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Soukup, Ondřej (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Anita Székelyová Školitel: Prof. Gunnar Tobin, O.D., Ph.D. Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv zánětu na expresi podtypů muskarinových receptorů - Imunohistochemie slzních a slinných žláz potkana a člověka Tento projekt byl zaměřený na charakterizaci exprese podtypů muskarinových receptorů v slzních a slinných žlázách potkana. K odhalení přítomnosti M1, M3 a M5 receptorů byly využity imunohistochemické metody a exprese těchto podtypů byla dále studována při experimentálně navozeném zánětu. Exprese výše zmiňovaných podtypů muskarinových receptorů byla taktéž studována v lidských pyskových žlázách zdravých a postižených autoimunitní sialadenitídou kompatibilní se Sjögrenovým syndromem. Muskarinové receptory M1, M3 a M5 byly nalezeny v slzních a podčelistních žlázách potkana s využitím imunoenzymové a imunofluorescenční metody. M5 receptor byl v slzní žláze detekován v nitrobuněčném, eventuálně jaderném umístění. Tkáň s navozeným zánětem nevykazovala žádné významné změny v expresi muskarinových receptorů. Imunofluorescenční značení M1 receptoru v lidských pyskových žlázách se Sjögrenovým syndromem naznačilo mírnou down-regulaci tohoto podtypu. M3 receptor byl up-regulovaný,...
|
|
|
Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Rudolf Andrýs Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Enzymy redukující karbonylové skupiny se účastní metabolismu mnohých endogenních i exogenních látek. Většina dosud popsaných enzymů účastnících se metabolismu xenobiotik je cytosolických, jediným takovým zatím známým mikrosomálním enzymem je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Podílí se také na metabolismu oracinu, prochirálního protinádorového léčiva, které je redukováno na (+) a (-) 11-dihydrooracin (DHO). Na základě rozdílů stereospecifit mezi lidskou mikrosomální frakcí a 11β-HSD1 se předpokládá podíl dalšího mikrosomálního enzymu na biotransformaci oracinu. Cílem této práce je potvrzení přítomnosti a purifikace tohoto nového lidského mikrosomálního enzymu. Lidské jaterní mikrosomy byly solubilizovány a odsoleny. Jako první purifikační krok byla využita Q-sepharosa. Vybraná frakce Q2, získaná touto metodou, byla podrobena druhému purifikačnímu kroku na Phenyl-sepharose. Jedna ze získaných frakcí splňující požadavky byla dále přečištěna gelovou filtrací. Ve všech frakcích získaných během purifikace byla stanovena redukční aktivita vůči...
|
|
|
Lidská mikrosomální glutathion-S-transferasa
Hrnčiarik, Karel ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Mikrosomální glutathion-S-transferasy (MGST) se účastní druhé fáze biontrasnformace v eukaryotických buňkách a prokaryotických buňkách organismů. Hrají významnou roli v obraně proti kancerogenním, toxickým a farmakologicky aktivním elektrofilním sloučeninám. Mikrosomální glutathion-S-transferasa je membránově vázaný enzym ve formě trimeru, který katalyzuje konjugaci elektrofilních sloučenin s glutathionem a redukci lipidických peroxidů. Peroxidasová aktivita MGST může být důležitá pro ochranu proti lipidické peroxidaci za podmínek oxidačního stresu. Řada biochemických přístupů se užívá pro studování vlastností MGST, tj. enzymové aktivity, nitrobuněčné distribuce, substrátové specifity a bílkovinné struktury. MGST jsou součásti nadrodiny MAPEG (membránově vázané enzymy v metabolismu ikosatetraenových kyselin a glutathionu). Do této nadrodiny patří na základě strukturální a fylogenetické podobnosti enzymy: MGST 1, MGST 2, MGST 3, mikrosomální Ya-GST, prokaryotické MGST tj. MGST bakterie E.Coli a MGST cyanobakterie nazývaná SynMGST (Bressel se sp. 2004) prostaglandin-E-syntasa, aktivující protein 5-lipoxygenasu a leukotrien-C4-syntasu. Enzymy této nadrodiny jsou zapojeny do detoxifikace, ochrany před oxidačním stresem a syntézy prostaglandinu E a cysteinyl-leukotrienu. Na základě pochopení funkcí MGST...
|
|
|
Role reduktas v nádorovém onemocnění.
Škarydová, Lucie ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Souhrn Redukčním enzymům byla dlouhou dobu věnována pouze malá pozornost, ale dnes už je jasné, že jsou významnou součástí endogenního metabolismu a také první fáze biotransformace xenobiotik. Důležitou skupinou redukčních enzymů jsou karbonylreduktasy, které se řadí do dvou nadrodin - dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR) a aldo-ketoreduktasy (AKR). Jejich role v nádorovém onemocnění je dnes intenzivně studována a lze říct, že jejich působení v nádorovém onemocnění lze principiálně rozdělit do dvou oblastí. Bylo zjištěno, že významnou roli hrají karbonylreduktasy v hormon-dependentních nádorových onemocněních prsu, endometria a prostaty. Pro tyto nádory jsou růstovými faktory aktivní estrogeny respektive androgeny, dochází tak ke zvýšenému dělení buňky a tedy i zvýšené možnosti vzniku mutací v důležitých genech, které mohou vyústit v nádorové bujení. Právě karbonylreduktasy se spolu s dalšími enzymy (jako např. aromatasou) podílí na vzniku aktivních pohlavních hormonů, proto může být jejich inhibice důležitým cílem léčby tohoto typu nádorů. Nicméně je nutné určit, které enzymy jsou klíčové pro tvorbu těchto růstových faktorů v jednotlivých typech hormon-dependentních nádorů. Vedle hormon-dependentních nádorů se karbonylreduktasy uplatňují také u nádorových onemocnění, kde hormony jako růstové...
|
|
|
Enzymová aktivita rekombinantních enzymů. Vliv histidinové kotvy.
Navrátil, Václav ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Václav Navrátil Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Enzymová aktivita rekombinantních enzymů. Vliv histidinové kotvy. AKR1B1, AKR1C1 a AKR1C3 jsou tři zástupci z dosud popsaných 15 lidských enzymů nadrodiny AKR. V těle se účastní celé řady biochemických drah a jejich substráty zahrnují jak xenobiotika, tak endogenní látky. Redukce glukosy na sorbitol, katalyzovaná AKR1B1, je spojována s rozvojem sekundárních diabetických komplikací. AKR1B1 se rovněž podílí na kardiotoxickém účinku cytostatika daunorubicinu. AKR1C1 je fyziologicky odpovědná za přeměnu progesteronu na méně účinný 20α-hydroxyprogesteron, čímž reguluje gestagenní aktivitu. Zvýšená exprese AKR1C1 může mít spojitost s rezistencí na některá cytostatika. AKR1C3 u lidí katalyzuje reakce, při kterých vzniká testosteron a 5α-DHT a je rovněž spojována s rozvojem několika druhů rakoviny. Právě významné zapojení těchto enzymů do řady patologických procesů vedlo k jejich bližšímu zkoumání. Cílem této práce bylo posoudit vliv histidinové kotvy a použitého pufru na aktivitu rekombinantních forem těchto enzymů, které jsou běžně používány v biotransformačních studiích léčiv nebo jiných xenobiotik. Nejprve byla pomocí...
|
|
|
Purifikace a charakterizace vybrané lidské mikrosomální reduktasy
Skarka, Adam ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Živná, Lucie (oponent)
Oblast lidských jaterních mikrosomálních reduktas není ještě ani zdaleka prozkoumána. Purifikace a charakterizace dosud nepopsaných enzymů je důležitým krokem k dokončení tohoto úkolu. V mé práci je popsána separace a purifikace těchto reduktas s využitím hydrofobně- interakční chromatografie na nízkotlakém chromatografickém přístroji ÄKTA purifier. Použity byly dvě kolony s různým substrátem, Fenyl sepharosa (low sub) a Oktyl sepharosa. Podmínky separace byly v obou případech nastaveny shodně. Výsledky získané inkubací jednotlivých frakcí a následným měřením na HPLC jednoznačně prokázaly rozdíly mezi oběma kolonami a jejich substráty. Nelze ovšem jednoznačně určit, která kolona je pro purifikaci vhodnější, protože stále zbývá velký prostor pro úpravu a optimalizaci purifikačních podmínek.
|
host ::
RSS.