|
|
Patofyziologické aspekty myelodysplastického syndromu ve vztahu k efektu cílené imunomodulační a demetylační terapie
Jonášová, Anna ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Maisnar, Vladimír (oponent) ; Faber, Edgar (oponent)
Myelodysplastický syndrom (MDS) představuje heterogenní skupinu klonálních chorob hemopoetické kmenové buňky charakterizovaných inefektivní hemopoézou, periferní cytopenií, morfologickou dysplazií a nebezpečím transformace do akutní myeloidní leukemie (AML). Jde o jedno z nejčastějších hematologických závažných onemocnění u nemocných starších 60 let. Jeho incidence stále stoupá. Terapie myelodysplastického syndromu je dosud relativně svízelná. Mimo transplantaci periferních kmenových buněk není v současné době k dispozici léčba vedoucí ke kompletní dlouhodobé remisi onemocnění. Transplantace ale pro většinou vyšší věk nemocných může být nabídnuta jen velmi malému procentu nemocných. Proto hledání nových terapeutických možností je zásadní. Do recentního zavedení dvou nových terapeutických modalit byla situace v léčbě nemocných s myelodysplastikým syndromem frustrující. Nové terapeutické přístupy jsou představovány imunomodulační léčbou representovanou preparátem lenalidomidem a epigenetickou terapií neboli demetylační léčbou representovanou preparátem 5- azacitidinem (azacitidin). Oba tyto nové léky mají významně vyšší efekt než dosud používaná léčba. Mechanismus jejich účinku však není ještě zcela objasněn. Proto jsem se rozhodla při zavádění této léčby u nás iniciovat několik výzkumných záměrů....
|
|
|
Epigenetické aspekty normální a nádorové krvetvorby: role chromatin remodelační ISWI ATPázy.
Zikmund, Tomáš ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent) ; Otáhal, Pavel (oponent)
Chromatin remodelační protein Smarca5 se účastní řady buněčných procesů, které jsou důležité jak z hlediska vývoje tkání, tak i z pohledu nádorové biologie. Mezi procesy, v průběhu kterých Smarca5 remodeluje chromatinovou strukturu, patří například genová transkripce, replikace a opravy poškozené DNA. Předpokládali jsme, že Smarca5 představuje esenciální molekulu pro modulaci chromatinu především ve vývojově časných a rychle se dělících progenitorech tkání, u nichž se často objevuje i zvýšená hladina transkriptu této ATPázy. Jednou z takovýchto tkání je i krvetvorba. Předmětem předkládané disertační práce je analýza vlivu deplece Smarca5 na proliferaci a diferenciaci krvetvorných progenitorů in vivo a zároveň hledání mechanizmů narušení jejich vývoje. Pomocí námi vytvořeného myšího modelu s podmíněně deletovatelnou alelou (angl. "conditional knockout") genu Smarca5 v krvetvorných kmenových buňkách jsme zjistili, že deplece této ISWI ATPázy způsobuje akumulaci časných hematopoetických protenitorů a inhibici jejich maturace směrem do erytroidní a myeloidní řady. Proerytroblasty vykazovaly dysplastické změny a u podstatné frakce bazofilních erytroblastů se objevovala zástava buněčného cyklu na rozhraní fází G2/M. Předpokládaným mechanizmem pozorovaných změn se ukázala být aktivace stresové dráhy...
|
|
|
Differentiation plasticity of hematopoietic cells
Polgárová, Kamila ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Otáhal, Pavel (oponent) ; Šálek, Cyril (oponent)
Hematopoéza byla mnoho let považována za nezvratný přímočarý proces, který postupným omezováním liniové plasticity vedl k vzniku zralých krevních elementů. V posledních letech se však objevily práce, které poukazují na nečekaně široký potenciál hematopoetických buněk, kdy i z lymfoidních prekurzorů můžou vzniknout zralé myeloidní buňky a naopak. Za fyziologických okolností je krvetvorba striktně regulována a definitivní osud buněk je ovlivněn mnoha faktory, které vedou ke změnám regulačních sítí zahrnujících transkripční faktory, epigenetické či post-transkripční modulátory. Jakékoli narušení této přísné kontroly, způsobené mutacemi nebo jinými událostmi, ovlivňuje proliferaci a liniovou plasticitu hematopoetických prekurzorů. To může vést ke klonálnímu růstu rozličné signifikance či k leukemogenezi. Změny v jednotlivých dráhách pak mohou ovlivnit i citlivost hematologických malignit na léčbu. Pro lepší pochopení hematopoetické regulace jsme se rozhodli popsat změny genové exprese v průběhu fyziologického vývoje zdravých lymfoidních a myeloidních buněk, jakož i u buněk leukemických a to pomocí vlastní zjednodušené platformy založené na PCR v reálném čase. V sortovaných hematopoetických progenitorech a jejich maligních protějšcích jsme vyšetřili expresi 95 genů spojených s diferenciací vybraných...
|
|
|
Regulatory mechanisms in normal and malignant granulopoiesis
Kardošová, Miroslava ; Alberich Jorda, Meritxell (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Balounová, Jana (oponent)
Neutrofily, známé hlavně jako klíčové buňky přítomné při obraně proti patogenům, představují nedílnou součástí přirozené ataké adaptivní části imunitního systému. Nepřetržitá produkce velkého množství neutrofilů je zajišťována komplexním procesem zvaným granulopoeza. Aby bylo možné udržovat stabilní počet neutrofilů, granulopoeza musí být přesně regulována. Narušená regulace granulopoezy může vést k poškození funkčnosti kostní dřeně, a nakonec až k vzniku akutní myeloidní leukemie (AML). Ani desetiletí výzkumu neobjasnili mechanizmy regulace granulopoezy úplně. Bylo však prokázáno, že rodina transkripčních faktorů zvaná CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) je v tomto procesu důležitá. Transkripční faktor C/EBPα funguje jako jeden z hlavních regulátorů granulopoezy tím, že řídí expresi mnohých genů zabezpečujících diferenciaci granulocytů. Pro pochopení molekulárních mechanizmů regulujících granulopoezu je proto důležitá charakterizace nových genů, které jsou řízené transkripčním faktorem C/EBPα. V předchozí studii jsme prokázali, že jiný člen C/EBP rodiny, CEBPG, je cílovým genem transkripčního faktoru C/EBPα. V první části této práce jsme zkoumali dosud neznámou roli transkripčního faktoru C/EBPγ v granulopoeze. Naše pozorování ukázala, že Cebpg knockout (KO) myši, které měly gen Cebpg...
|
|
|
Vývoj a testování buněčných modelů kondiciální inaktivace ISWI ATPázy Smarca5
Tauchmanová, Petra ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Burda, Pavel (oponent)
Jaderné procesy eukaryotických buněk (replikace, transkripce, opravy poškozené DNA a další) jsou z velké části závislé na regulaci chromatinové struktury. Dynamické regulace změn na úrovni chromatinové struktury se účastní i chromatin-remodelační faktory, využívající energii z hydrolýzy ATP. Jedním z těchto faktorů je protein Smarca5 (Snf2h), který je schopen samostatně, nebo s pomocí vazebných partnerů, lokálně měnit strukturu chromatinu. Cílem této práce bylo vytvořit a následně otestovat in vitro model myších embryonálních fibroblastů (MEF) s podmíněnou (kondiciální) delecí genu Smarca5 a testovat vliv této delece na obecné buněčné procesy, jimiž jsou například regulace buněčného cyklu, schopnost proliferace či proces opravy poškozené DNA. Výsledky naznačují, že u linií s deplecí proteinu Smarca5 dochází k výraznému narušení rychlosti proliferace již několik dní po indukci delece. Toto narušení proliferace je doprovázeno zvyšující se ploiditou a snížením množstvím buněk v S fázi a v mitóze. Po depleci proteinu Smarca5 bylo v liniích pozorováno také zvýšené zastoupení buněk v senescenci. Imunoblotová analýza ukázala, že u buněk po depleci Smarca5 dochází k nárůstu markerů indukujících poškození DNA. Získaná data naznačují, že protein Smarca5 hraje roli převážně v replikaci a pravděpodobně v...
|
|
|
Epigenetické regulační faktory CTCF a SMARCA5 kontrolují expresi hematopoetického transkripčního faktoru SPI1 v buňkách akutní myeloidní leukémie a myelodysplastického syndromu.
Dluhošová, Martina ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Machová Poláková, Kateřina (oponent) ; Kozák, Tomáš (oponent)
CCCTC-vázající faktor (CTCF) má schopnost aktivovat a tlumit transkripci genů mechanizmem vytváření chromatinových smyček, jež spojují regulační oblasti s promotory, na nichž je zahájena transkripce RNA. Metylace DNA představuje modifikaci cytosinových nukleotidů, jež má regulační vlastnosti a je vytvářena jaderným enzymatickým aparátem. Regulační role CTCF tkví ve vazbě na nemetylovanou DNA a interakci s dalšími bílkovinami kohezinového komplexu vedoucí k ovlivnění transkripce sousedících genů; například genů pro H19 a Igf2. Role CTCF v krvetvorbě je předpokládána a řada prací ukazuje i na význam CTCF pro vznik leukemické transformace a nadúměrné produkci klonálních myeloblastů, avšak přesný mechanizmus těchto procesů není znám. Imprinting je epigenetický mechanizmus pro regulaci transkripce skrze metylaci DNA a CTCF, jež je využívána při maternálním a paternálním přenosu genetické informace do zygoty. Mezi molekulární mechanizmy CTCF patří takzvaný blokující efekt, kterým CTCF odstraní vliv regulační zesilovací (‚enhancerové') sekvence na funkci promotoru. V naší výzkumné práci jsme si položili otázky vedoucí ke zjištění role CTCF v krvetvorbě. Výsledky mé práce potvrzují, že se CTCF váže do kontrolní oblasti pro geny H19 a Igf2. V mé práci jsme identifikovali nového vazebného partnera pro CTCF,...
|
|
|
Investigating critical mechanisms of oncogenesis using cell model systems
Hušková, Hana ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Vojtěšek, Bořivoj (oponent)
(CZ) Lidé jsou v průběhu života vystaveni různým faktorům způsobujícím poškození DNA, vedoucí ke změnám v buněčné fyziologii a potenciálně k expanzi imortalizovaného buněčného klonu a vzniku nádoru. Mutace v DNA jsou jak záznamem o působení mutagenních procesů, tak klíčem k biologii a patofyziologii nádorů. Masivně paralelní sekvenování umožňuje sekvenování všech kódujících sekvencí či dokonce celých genomů lidských nádorů. Z těchto dat je možné získat vzorce mutací typické pro jednotlivé mutagenní procesy, stejně jako poukázat na mutace a geny hrající roli při vzniku a vývoji nádoru. Řada popsaných vzorců mutací však nemá známou příčinu a řada známých karcinogenů nemá dosud přiřazen mutační vzorec. Stejně tak se předpokládá, že dosud není známa řada mutací a genů s vlivem na vznik nádoru. Tato disertační práce charakterizuje experimentální systém založený na imortalizaci myších embryonálních fibroblastů (MEF) za působení mutagenu, umožňující určení vzorců mutací daných mutagenů a určení mutovaných genů důležitých pro vznik nádoru. Kultivace buněk MEF vede k jejich senescenci, která může být překonána mutacemi ve funkčně důležitých genech, analogicky ke stádiím vzniku lidských nádorů. Sekvenování kódujících sekvencí 25 imortalizovaných buněčných linií, které vznikly za působení rozličných mutagenů...
|
|
|
Modely anemických onemocnění
Vondráková, Zuzana ; Bartůněk, Petr (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent)
Hematopoéza je proces, kterým se utváří krevní buňky. Všichni obratlovci mají dvě fáze hematopoézy - primitivní a definitivní. Základním smyslem primitivní hematopoézy je produkce červených krvinek, které umožňují okysličení tkání embrya. Definitivní hematopoéza pak dá vzniknout všem krevním buněčným liniím. Hlavním úkolem erytrocytů je transport kyslíku ke tkáním. Pokud z nějakého důvodu dojde ke snížené produkci erytrocytů, k poškození jejich membrány, enzymatického vybavení erytrocytu či k poruše tvorby hemoglobinu, nastává anémie. Srpkovitá anémie a β-thalasémie se souhrnně nazývají hemoglobinopatie, protože jsou způsobeny poruchou hemoglobinizace erytrocytů. Fanconiho anémie je zapříčiněna mutacemi v jednom z jednadvaceti genů dráhy Fanconiho anémie, které se účastní oprav DNA. Diamondova-Blackfanova anémie vzniká jako odpověď na mutaci v genech kódujících ribozomální proteiny. Lidské buňky, Mus musculus, Gallus gallus, Xenopus laevis a Danio rerio se jeví jako vhodné modely pro studium těchto onemocnění a jsou také velmi užitečné pro hledání dalších terapeutických cílů.
|
|
|
Identification and functional characterization of C/EBPalpha targets in normal and malignant hematopoiesis
Zjablovskaja, Polina ; Alberich Jorda, Meritxell (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Fuchs, Ota (oponent)
Hematopoetickýsystémpředstavujevysoceorganizovanoustrukturu,kterákesvému správnémufungovánívyžadujepřesnouregulaci.Aberantnívývojkrevníchbuněkmůževést khematologickýmporuchám,jakojenapř.akutní myeloidníleukémie(AML).Správné fungování hematopoetickéhosystémuzávisízvelkéčásti natranskripčníchfaktorech. TranskripčnífaktorC/EBPjeznámjakojedenzhlavníchregulátorůkrvetvorbyajenezbytný profunkčnosthematopoetickýchkmenovýchbuněkavývojbuněkmyeloidnílinie.Významná jetakéskutečnost,žezměnyexpreseC/EBP bylydetekoványuvelkéčástipřípadůAML. C/EBPregulujekrvetvorbuzejménaprostřednictvímregulaceexpresesvýchcílovýchgenů. Byloprokázáno,žeřadatěchtogenůsenasystémukrvetvorbypodílíahrajerolipřileukemické transformaci.IdentifikacenovýchcílovýchgenůC/EBPajejichfunkčnícharakterizacesetak stávázajímavýmpředmětemvýzkumu.Vtétoprácijsmeidentifikovalisouborgenů,jejichž expresejenaaktivitěC/EBPzávislá,tzv."signaturu"C/EBP.Prokázalijsme,žeinhibitory histon-deacetyláz(HDAC)obnovujíexpresitěchtogenůvbuňkáchsnefunkčnímC/EBPa indukujímyeloidnídiferenciacivevzorcíchAMLsbialelickýmimutacemiCEBPA,kterése vyznačujísníženouexpresísignaturyC/EBP.Výzkumzaměřenýnajedenkonkrétnícílový gen C/EBP,EVI2B,dáleprokázal,žeproteinkódovanýtímtogenemjenezbytnýkesprávné...
|
|
|
Role of Smarca5 (Snf2h) chromation remodeling ATPase in hematopoitic development and erythropoiesis
Kokavec, Juraj ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Divoký, Vladimír (oponent) ; Kořínek, Vladimír (oponent)
Jaderný protein Smarca5 (Snf2h) je jeden z nejvíce konzervovaných chromatin remodelačních faktorů a molekulárních motorů u savců. ATPáza Smarca5 (a ostatní příbuzní zástupci proteinové nadrodiny SWI/SNF2) společně se svými vazebnými partnery vytváří několika podjednotkové remodelační komplexy, jež posouvají, odstraňují nebo přináší histonové oktamery na DNA za účelem regulace trankripce, replikace, oprav poškození DNA a jiných nepostradatelných buněčných funkcí. Ve své disertační práci se zabývám studiem myšího modelu delece genu Smarca5 na počátku definitivní krvetvorby. Jedinci s delecí genu Smarca5 v hematopoetické kmenové buňce (aktivní promotor Vav1) umírají během pozdního vývoje in utero v důsledku závažné anémie. Ve fetálních játrech těchto experimentálních zvířat jsme pozorovali akumulaci krvetvorných kmenových a progenitorových buněk (HSPCs) a inhibici jejich dozrávání do erythroidní a myeloidní buněčné řady. Popsané poruchy vývoje byly doprovázeny dysplastickými změnami na úrovni proerytroblastů a poruchami buněčného cyklu na přechodu z G2 do M fáze u bazofilních erytroblastů. Dále jsme pozorovali, že nedostatečná funkce Smarca5 zvyšuje hladinu tumor supresorového proteinu p53 v erythroidních progenitorech, aktivaci jeho transkripčních cílů a k postranslačním modifikacím, jež jsou...
|
host ::
RSS.