|
|
Studium systému oxidativní fosforylace u vzácných typů mitochondriálních onemocnění
Zdobinský, Tomáš ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Pecinová, Alena (oponent)
Buňky savců jsou ve svém bioenergetickém metabolismu závislé na produkci ATP především pomocí systému oxidační fosforylace (OXPHOS). Poruchy správné funkce OXPHOS mohou vést ke vzniku dědičných mitochondriálních onemocnění s různou závažností a rozmanitými projevy. Nejvážněji bývají zasaženy tkáně s vysokými energetickými nároky, které jsou však obtížně dostupné pro biochemická a jiná vyšetření. Cílem práce bylo především charakterizovat dopady mutací sedmi různých genů (OPA1, DARS2, NDUFS8, NR2F1, HTRA2, MGME1, POLG) na bioenergetický metabolismus a strukturu mitochondrií kožních kultivovaných fibroblastů osmi pacientů s mitochondriálním onemocněním. Hlavní použitou metodou bylo měření spotřeby kyslíku permeabilizovanými buňkami pomocí vysoce citlivé polarografie. Tímto způsobem byly zjištěny výrazné změny v respiraci fibroblastů čtyř pacientů. U dvou z nich a dvou dalších linií byly pomocí fluorescenční mikroskopie zjištěny změny morfologie mitochondriálního retikula oproti kontrolám při použití různých kultivačních podmínek. Kožní fibroblasty jsou relativně snadno dostupné a nabízí řadu výhod pro účely diagnostiky i studia. Výsledky této práce ilustrují možnosti jejich využití mj. pro validaci potenciálních kauzálních mutací mitochondriálních onemocnění, především však v kombinaci s dalšími...
|
|
|
Implementation of industrial X-ray computed microtomography in developmental biology
Tesařová, Markéta ; Křivánek,, Jan (oponent) ; Novotná, Marie (vedoucí práce)
X–ray computed microtomography (CT) is an imaging method for three-dimensional (3D) observation of the inner structure of objects. The laboratory of X-ray computed micro and nanotomography at CEITEC BUT (Central European Institute of Technology, Brno University of technology) is predominantly focused on non-destructive analysis in the industry. However, it has resulted that this approach can also be applied in various scientific fields including developmental biology. This thesis provides a connection between the world of material and life sciences. The complete procedure for creating a 3D model of diverse anatomical structures is described in detail. This process consists of staining, a CT measurement and data-processing. Analysis of data is often considered the most important part of CT method, so the most part of this thesis is devoted to this area. In addition, the parameters of GE v|tome|x L 240 were optimised to automate the segmentation process. Furthermore, the possibility of synchrotron measurement is proposed in order to increase the spatial resolution and differential contrast. It is envisioned that in the near future industrial CT setups will acquire similar imaging properties due to the recent development in both hardware and data-processing directions.
|
|
| |
|
|
Delece v lidské mitochondriální DNA a příčiny jejich vzniku
Zdobinský, Tomáš ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Kazantsev, Dmitry (oponent)
Mitochondrie jsou organely eukaryotních buněk zajišťující především energetický metabolismus, podílí se však i na metabolických dějích jako je biosyntéza aminokyselin, hemových skupin, železosirných komplexů aj. Mitochondriální poruchy představují heterogenní skupinu onemocnění, která se mohou projevit jak v dětském, tak v dospělém věku. Postihují odlišným způsobem různé tkáně a orgány, nejčastěji se však projeví poruchami nervového systému, kosterní svaloviny, případně jater, ledvin nebo endokrinní soustavy. Delece mitochondriální DNA se podílejí na patologii mnoha z těchto onemocnění a jsou příznakem několika syndromů. Vznikají pravděpodobně v důsledku zastavení replikačního aparátu během replikace mitochondriální DNA a následného vzniku dvouřetězcového zlomu. To může být způsobeno především patogenními změnami proteinů replikačního aparátu a metabolismu nukleotidů. Cílem této práce je shrnutí poznatků o stavbě mitochondrií a struktuře a replikaci jejich genomu, ale především vytvoření přehledu nejdůležitějších proteinů, jejichž mutace vede ke vzniku mitochondriálních onemocnění doprovázených delecemi v mtDNA, a poznatků o mechanismu jejich vzniku.
|
|
| |
|
|
Kapacita mitochondriálního energetického metabolismu v kultivovaných kožních fibroblastech
Daňhelovská, Tereza ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Ješina, Pavel (oponent)
Mitochondriální onemocnění patří, se svojí incidencí 1:5000 živě narozených dětí, k jedněm z nejčastějších metabolických poruch. Jedná se o klinicky heterogenní skupinu chorob způsobenou mutacemi ve více než 250 genech. Diagnostika pacientů s podezřením na mitochondriální onemocnění obnáší celou řadu biochemických analýz. Jednou z nich je i analýza kapacity mitochondriálního energetického metabolismu (KMEM). Jedná se o sledování oxidace 14 C značených substrátů pyruvátu, malátu a sukcinátu v sérii 10 inkubacích, které obsahují různé donory a akceptory acetyl-CoA a inhibitory Krebsova cyklu. Výsledky analýzy KMEM nám podávají široké spektrum informací o mitochondriálním energetickém metabolismu daného jedince v konkrétní tkáni. V rámci diagnostiky pacientů s podezřením na mitochondriální onemocnění je KMEM stanovována v kosterním svalu. Cílem práce je optimalizovat metodu analýzy KMEM pro její využití v kultivovaných kožních fibroblastech. Celkem byla analýza KMEM v kultivovaných kožních fibroblastech provedena u 23 pacientů s primárním deficitem systému oxidativní fosforylace (OXPHOS), u 7 pacientů se sekundárním deficitem OXPHOS a u 15 kontrolních linií. Výsledky analýzy KMEM v kultivovaných kožních fibroblastech byly následně porovnány s výsledky spektrofotometrického měření aktivit jednotlivých...
|
|
|
Systém oxidativní fosforylace a metody analýzy jeho funkce
Daňhelovská, Tereza ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Míčová, Petra (oponent)
Systém oxidativní fosforylace (OXPHOS) je hlavním a nepostradatelným zdrojem energie (ATP) eukaryotické buňky. Je to komplexní proces, situovaný ve vnitřní mitochondriální membráně, na kterém se podílí 4 enzymy dýchacího řetězce, 2 mobilní přenašeče a ATP syntáza. Narušení jakékoli části OXPHOS může vést k mitochondriálnímu onemocnění. S incidencí přibližně 1:5000 se mitochondriální onemocnění řadí mezi jedny z nejčastějších vrozených metabolických poruch. Klinicky se jedná o velmi heterogenní skupinu chorob, postihující zejména energeticky náročné tkáně (mozek, srdce, svaly). Vzhledem k širokému spektru klinických projevů a relativně slabé korelaci mezi genotypem a fenotypem mitochondriálních onemocnění se upřednostňuje kompletní laboratorní diagnostika, zahrnující celou řadu biochemických a molekulárně genetických metod. Tato bakalářská práce shrnuje dosavadní informace o mechanismu OXPHOS a popisuje hlavní tři současně používané metody k charakterizaci jeho funkčnosti. Jedná se o metody: spektrofotometrické měření aktivit jednotlivých komplexů OXPHOS, měření kapacity mitochondriálního energetického metabolismu pomocí radioaktivně značených substrátů a polarografické měření spotřeby kyslíku. K co nejpřesnější charakterizaci funkce OXPHOS by měla být využita kombinace více metod a to nejlépe na...
|
|
|
Genetické příčiny deficitu cytochrom c oxidázy u dětí
Vondráčková, Alžběta ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Brdička, Radim (oponent) ; Procházková, Dagmar (oponent)
Mitochondrie jsou hlavním, nepostradatelným zdrojem ATP, který je produkován především systémem oxidativní fosforylace (OXPHOS). Mutace v genech podmiňujících správnou funkci OXPHOS způsobují mitochondriální onemocnění, jejichž incidence je odhadována na 1:5000 živých narozených dětí. Cytochrom c oxidáza (COX) je klíčovým enzymem dýchacího řetězce, který katalyzuje přenos elektronů na kyslík za vzniku molekuly vody. Izolované nebo kombinované poruchy aktivity COX jsou spolu s deficitem komplexu I nejčastějším typem mitochondriální poruchy u dětí. Způsobeny jsou mutacemi v mitochondriálních nebo jaderných genech kódujících strukturní podjednotky a asemblační faktory jednotlivých komplexů OXPHOS. Přesná genetická podstata poruchy aktivity COX však zůstává u mnoha pacientů neobjasněna navzdory vzrůstajícímu počtu nově charakterizovaných genů. Cílem dizertační práce bylo popsat genetickou příčinu mitochondriálního onemocnění u skupiny 60 nepříbuzných dětí z České republiky s biochemicky potvrzenou poruchou COX. Optimalizovanou metodikou high-resolution melting byly identifikovány čtyři heterozygotní varianty v exonech genů COX4I2, COX5A, COX7A1 a COX10, které byly klasifikovány jako patologické, a proto jsou vhodnými kandidáty pro provedení cílené mutační analýzy u dětí s deficitem COX. Pomocí SNP DNA...
|
|
|
Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy
Suldovská, Sabina ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Černá, Leona (oponent)
F1FO-ATPsyntáza je klíčovým enzymem buněčného energetického metabolismu. Její případný deficit může být způsoben mutacemi ve dvou strukturních genech MT-ATP6 a MT- ATP8 v mitochondriální DNA či v jaderných genech ATPAF2 a TMEM70 kódující faktory pro biogenezi enzymu a strukturním genu ATP5E. Deficit F1FO-ATPsyntázy vede k rozvoji velmi závažného fenotypu postihující orgány s vysokými energetickými nároky s nástupem v novorozeneckém věku a nepříznivou prognózou. Mutace v uvedených genech navíc nezpůsobují pouze kvalitativní (mutace ve strukturních podjednotkách enzymu) či kvantitativní (mutace v genech pro faktory biogeneze enzymu) defekty, ale také jejich kombinace. Při studiu molekulární podstaty mitochondriálních onemocnění včetně deficitu F1FO-ATPsyntázy se využívá široká škála biochemických i molekulárně-genetických metod pro stanovení správné diagnózy, která je nezbytná pro včasné zahájení symptomatické léčby a genetické poradenství v postižených rodinách. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat deficit F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z linií kultivovaných buněk stanovením oligomycin-sensitivní ATP- hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy, enzymových aktivit komplexů dýchacího řetězce a sledováním změn v množství jednotlivých vybraných podjednotek a celého komplexu F1FO-...
|
|
| |
host ::
RSS.