|
|
Struktura a funkce glutamátkarboxypeptidasy II
Šácha, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
4 Závěr GCPII je důležitý protein, který hraje roli v mnoha fyziologických i patologických procesech. Proto bylo třeba získat větší množství enzymaticky aktivního proteinu pro jeho další biochemický výzkum. Heterologní expresí v hmyzích buňkách S2 bylo exprimováno a následně purifikováno dostatečné množství velmi čistého a aktivního enzymu. To umožnilo jeho biochemickou charakterizaci, krystalizaci a později vedlo i k vyřešení krystalové struktury. GCPII je aktivní v širokém rozmezí pH 6 - 8, s maximem kolem pH 7,5. Zjistili jsme, že kromě přirozeného substrátu Ac-Asp-Glu GCPII štěpí také acetylované dipeptidy Ac-Asp-Met, Ac-Glu-Met, Ac-Glu-Glu, Ac-Ala-Glu a Ac-Ala-Met. U těchto substrátů byly změřeny kinetické parametry štěpení. Nalezení dalších substrátů může vést k objevení dosud nepopsaných fyziologických rolí GCPII. Také byly porovnány hodnoty IC50 inhibitorů známých z literatury u námi připravené GCPII a GCPII izolované z potkaních mozků. IC50 bylo u všech méně specifických inhibitorů nižší u rekombinantní GCPII než u GCPII izolované z mozků. Rozdíly ve výsledcích vysvětlujeme vazbou méně specifických inhibitorů na jiné proteiny preparátů z mozku. Vůbec nepochybujeme o tom, že data získaná za použití čistého rekombinantního proteinu jsou přesnější než ta, ktará byla získána ze špatně definovaných...
|
|
| |
|
| |
|
|
Dipeptidyl peptidáza-IV a Fibroblastový aktivační protein v gliomagenezi.
Trylčová, Jana ; Šedo, Aleksi (vedoucí práce) ; Mandys, Václav (oponent) ; Mareš, Vladislav (oponent)
"Dipeptidylpeptidáze-IV aktivitou a/nebo strukturou homologní" (DASH) molekuly představují skupinu multifunkčních molekul, z nichž většina nese hydrolytickou aktivitu podobnou dipeptidylpeptidáze-IV (DPP-IV), která odštěpuje X-Pro dipeptidy od N-konce peptidů a bílkovin. Do této skupiny patří další molekuly nesoucí podobnou enzymovou aktivitu jako například fibroblastový aktivační protein (FAP), DPP-II, DPP8 a DPP9 nebo i DPP-IV strukturou podobné, ale hydrolyticky neaktivní molekuly (DPP6 a DPP10). Současné poznatky svědčí o významu těchto molekul v procesech vzniku a rozvoje řady nádorových onemocnění. Cílem této práce je příprava biologického modelu a jeho využití pro pochopení mechanizmů interakce transformovaných gliálních buněk s buňkami stromatu v procesech vzniku a rozvoje nádorů odvozených z neuroektodermu. V rámci projektu byly připraveny stabilně transfekované lidské glioblastomové buněčné linie s indukovatelnou expresí DPP-IV a fibroblastového aktivačního proteinu a jejich mutantních, enzymově neaktivních forem. Vzniklé buněčné linie jsou nadále používány nejen jako nástroj studia "autokrinního" významu DPP-IV a FAP pro vlastní exprimující transformované buňky v in-vitro modelech, tak i "parakrinního" působení na úrovni nádorového mikroprostředí po homotopní implantaci do...
|
|
|
Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II
Mlčochová, Petra ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Šedo, Aleksi (oponent)
ZAVER Nedávno publikované krystalové stÍuktuly GCPII poskytly náhled do organizace vazebné kapsy pro substrát a odhali|y něko|ik aminokyse|in, které se podílejína vazbě substrátu/inhibitoru vsl' místě enzymu. Abychom doplnili a rozšíři|istrukturní studie, vytvořili jsme QM/T\4M model GCPII v komplexu se substrátem, N.acetyl-aspartyl. glutamátem (NAAG). To nám umožnilo předpovědět dalšíaminokyseliny důleŽitépro vazbu substrátu. Využili jsme místně speciťrcké mutageneze. abychom odhalili vliv těchto jednotlivých aminokyselin na vazbu substÍátu/inhibitoru a na enzymovou aktivitu GCPII. Poěítačovýmodel komp|exu GCPIVNAAG společněs výsledky z místně specifické mutageneze, ukazuje žeaminokyse|iny v S1' místě (váaající glutarát) jsou nezbytné pro vysokou ďinitu substrátu nebo inhibitoru, zatímco, zbytky v s1 místě jsou více dťúežitépři přeměně substrátu a mohly by hrát nějakou roli v kata|ytickém mechanismu enzymu. Přestože QMA4M model nám umožni|předpovědět strukturu a interakce mezi substrátem a enzymem v Sl místě, komp|exní popis reakčníhomechanismu GCPII je zatím mimo rámec našich možností. V blízkébudoucnosti bychom se rádi dozvěděli víceinformací o katalytickém mechanismu GCPII. Chceme se zaměřit na Glu424' který je situovián v bezprostřední blízkosti zinkťr v aktivním místě a s největší pravděpodobností se...
|
|
| |
|
|
Posttranslational modifications in soluble recombinant therapeutical proteins secreted by lower aukaryotes: structure and function
Kumar, Vinay ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Grubhoffer, Libor (oponent)
Virral, Kunnr M.Sc Cíle dizertačnípráce cÍrn DISERTAČNÍpnÁcn Cílenr předkládarré dizertačrrípráce byIo poclropení rlolekulánríclr nleclranisnrů přispívajících ke tvorbě vysoce stabilních rozpustlrýc|r |orern receptorů přirozených zabíječských buněk. Jako modelový protein byl r.ybrán receptor CD69. Tento receptor je v přirozerrénl prostředí produkovárr jako dinlenrí nterrrbránor.ý protein stabilizovaný ponrocí 7 disulfidovýclr nrůstků a glykosylovaný na 4 nlístech ,\.-gl1.kosylací. Konkrétně byly v práci vytčeny následujícící|e: l. Vyvirrout nor'ou tlletodologii pro rychléa cit|ivé stanovení struktury disulfidových nrůstkůu sloŽitých eukaryotických proteirrů zaloŽenou na SDS polyakrylanlidové elektroťorese l'neredukujícíchpodrnírrkách a hnlottrosttrí spektrorrretrii. 2. Na|ézt základní struktunlí elenlenty kritické pro stabiIitu rozpustných CD69 receptorů produkovanýc|r v bakteriálnínl exprestrínr systénlu. 3. Vyvinout nretodu pro produkci glykosylovanýclr forenr rozpustných CD69 receptorů s použitínr vybraných kmenů kvasinky Pichia pastot.is. 4. Produkor'ané proteirry přečistit v nrlroŽství a čistotě dostatečnýclrpro biochelrrická stanor'etrí a inrunologické testy \,četně testů l/i l'll'o' 5. ZjistiÍ, jakým způsobetn tlroltou tvorba disu|fidových rrrůstkůa g|ykosylace ovlivnit stabilitu rozpustrrých CD69...
|
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.