|
|
Analýza exprese inhibitorů serinových proteáz v klíštěti \kur{Ixodes ricinus} pomocí kvantitativní real-time PCR
HAUSEROVÁ, Simona
Klíšťata ve svých slinách obsahují mnoho biologicky aktivních látek, které jim pomáhají úspěšně dokončit sání, jenž je nezbytné pro jejich další vývoj. Klíštěcí sliny obsahují nejen látky proteinového i neproteinového charakteru včetně proteázových inhibitorů. Největší rodinou těchto inhibitorů proteáz jsou serpiny, jež se zapojují do mnoha biologických procesů jako je koagulace krve, fibrinolýza, apoptóza či zánět. Cílem této diplomové práce bylo stanovit expresní profily 10 serpinů z různě nasátých nymf klíštěte Ixodes ricinus pomocí kvantitativní real-time PCR. Pro vybrané geny (IRS 10, IRS 20) byla připravena dsRNA pro silencing daného genu a pomocí RNA interference byla studována úloha těchto genů při sání nymf I. ricinus a přenosu spirochet lymeské boreliózy.
|
|
|
Nanofiber dressing consisting of antisense rna-functionalized nanodiamonds for therapy of non-healing wounds in diabetic individuals
Neuhoferová, Eva ; Petráková, V. ; Vocetková, K. ; Kindermann, Marek ; Křivohlavá, Romana ; Benson, Veronika
Non-healing wounds are serious complication in diabetic patients and represent an attractive challenge for development of suitable carrier system possessing constant and localized release of therapeutic biomolecule into the wound without any undesired side effects. Given the fact that these non-healing wounds are result of impaired balance in metalloproteinases synthesized by immune cells residing the wounds, gene therapy offering knock down of such enzymes is of great interest. \nHere we challenged a development of functional and biocompatible wound dressing enabling controlled release of trackable carrier loaded with therapeutic siRNA. Our dressing consists of scaffold from degradable polymer nanofibers enriched with fluorescent nanodiamond particles (FND). We have previously shown the nanodiamond particles are great carriers for antisense RNAs. Their advantages represent high biocompatibility, stable luminescence giving us the possibility to track the carrier system in the wound, and effective release of antisense RNA in the wound. Embedding of nanodiamond-siRNA systems into nanofiber scaffold enables continuous release of siRNA and maintaining the stable siRNA concentration in the wound site resulting in a promotion of wound healing. \nWe developed FND-siRNA complexes specific to MMP-9 that efficiently inhibit the expression of target MMP-9 mRNA. The complexes were embedded into core/shell nanofibers from PVA and PCL, visualized by confocal microscopy, and characterized by electron microscopy. Real-time PCR was used to assess the silencing effect of siRNA that has been delivered to target murine fibroblasts by FND released from nanofiber dressing. Nanofiber system with embedded FNDs was applied on wounds in diabetic animal models to evaluate its suitability regarding short and long term toxicity, efficacy, and handling in vivo. \n
|
|
|
Induction of endogenous RNAi in mammalian cells
Demeter, Tomáš ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Dvojvláknová RNA, je unikátna štruktúra s mnohými biologickými účinkami. Je tvorená z dvoch protichodných komplementárnych RNA vlákien, ktoré môžu byť produkované samotnými bunkami alebo sa do nich môžu dostať z vonkajších zdrojov. Existujú štyri hlavné mechanizmy jej vzniku: transkripcia z obrátených repetícií, konvergentná transkripcia, komplementárne párovanie (in trans) a syntéza sprostredkovaná RNA dependetnou RNA polymerázou. Rôzne mechanizmy produkcie určujú ďalšie štruktúrne vlastnosti dvojvláknových RNA, napríklad ich konce, chybne zaradenie nukleotidových báz a iné. Štruktúrne vlastnosti môžu ovplyvňovať to, akým spôsobom bunka odpovedá na prítomnosť dvojvláknových RNA. Táto odpoveď môže byť sekvenčne-špecifická alebo sekvenčne- nešpecifická. Hlavnou sekvenčne-špecifickou odpoveďou na prítomnosť dvojvláknovej RNA v bunke je RNA interferencia. Naša skupina študovala mechanizmus indukcie RNA interferencie v cicavčích bunkách pomocou špecifického typu dvojvláknovej RNA. Táto dvojvláknová RNA vytvára vlásenku s dlhými jednovláknovými presahmi na oboch koncoch. Predpokladali sme, že dvojvláknové RNA substráty s inými štruktúrami môžu byť efektívnejšie ako ten, ktorý sme požívali v našich experimentoch od roku 2002. Hlavným cieľom mojej diplomovej práce bolo porovnať účinnosť rôznych...
|
|
|
Indukovaná RNAi proti esenciálním genům metabolismu dusíku jako nástroj pro kontrolu GM rostlin
Kobercová, Eliška ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Tylová, Edita (oponent)
Jednou z obav při pěstování geneticky modifikovaných (GM) rostlin je nebezpečí jejich nekontrolovaného šíření. Možným nástrojem pro jejich kontrolu by teoreticky mohla být indukovaná RNA interference proti některému z životně důležitých genů. Po aplikaci indukční látky by došlo k umlčování exprese tohoto esenciálního genu a tím i k usmrcení GM rostliny rozšířené mimo vyhrazenou kultivační plochu. Pro testování této strategie a indukci umlčování byly v této práci zvoleny geny pro dva klíčové enzymy dusíkového metabolismu, glutamátsyntázu (GOGAT) a glutaminsyntetázu (GS). GS zpracovává amonné ionty do podoby glutaminu, GOGAT pak přenáší amidovou skupinu z glutaminu na 2-oxoglutarát za vzniku dvou glutamátů. GS a GOGAT jsou hlavní cestou na zpracování amonných iontů, které mohou být ve zvýšené míře pro rostliny toxické a blokování jejich fixace při fotorespiraci vede k silné inhibici fotosyntézy. Cílem této práce bylo popsat projevy umlčování genů pro GOGAT a GS u modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Pro umlčování byly připraveny vlásenkové konstrukty pod konstitutivním nebo pod estradiolem-indukovatelným promotorem. U vybraných transformantů nesoucích vlásenku proti GOGAT byly při aplikaci estradiolu v in vitro podmínkách pozorovány projevy umlčování tohoto genu projevující se jako chloróza a...
|
|
|
Metody RNAi a CRISPR a jejich využití pro genetické manipulace parazitických protist
Kaiserová, Veronika ; Votýpka, Jan (vedoucí práce) ; Stojanovová, Darja (oponent)
RNA interference slouží jako obranný mechanismus, pomocí něhož se organismy brání proti cizorodým nukleovým kyselinám. RNAi negativně ovlivňuje translaci vazbou malých nekódujících molekul RNA ke komplementárnímu úseku mRNA, která je následně degradována. Novinkou v oblasti genového inženýrství je metoda CRISPR, která spočívá v modulaci genové exprese tvorbou dvouvláknových zlomů v cílové sekvenci DNA pomocí ribonukleoproteinového komplexu složeného z prokaryotické endonukleázy Cas9 a sgRNA. Obě zmíněné metody jsou použitelné pro funkční analýzu proteinů a charakterizaci metabolických drah u studovaných organismů. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o metodách RNAi a CRISPR a o jejich využití k editaci genomů parazitických protist.
|
|
|
Využití metody RNA interference (RNAi) ke studiu onkogenních vlastností viru Kaposiho sarkomu (KSHV).
Riegerová, Petra ; Lubyová, Barbora (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Pávová, Marcela (oponent)
Souhrn Virus Kaposiho sarkomu (KSHV) je onkogenní DNA virus, jenž je spojován se všemi epidemiologickými formami Kaposiho sarkomu, primárního efuzního lymfomu (PEL) a s Castlemanovou chorobou (MDC). Stejně jako ostatní herpesviry prochází KSHV dvěma fázemi životního cyklu (latentní a lytická replikace). Během latentní fáze persistuje virový genom ve formě cirkulárního epizómu v jádře infikovaných buněk, kdy se exprimuje pouze několik latetních genů: LANA (latency-associated nuclear antigen), Kaposin, vFLIP (viral FLICE inhibitory protein), vCyklin a vIRF3/LANA2 (viral interferon regulatory factor 3). Tyto geny jsou pak zodpovědné za regulaci proliferace hostitelské buňky, prevenci apoptózy, únik před imunitním systémem a udržení extrachromozomálního virového genomu během dělení. vIRF3 je multifunkční jaderný protein konstitutivně exprimovaný u KSHV pozitivních PEL buněk a u nádorů Castlemanovy choroby, jehož exprese působí dramatické změny v kritických hostitelských drahách zahrnutých při regulaci apoptózy, buněčného cyklu, protivirové imunitě či onkogenní transformaci. V naší práci se nám podařilo prokázat a lépe dokumentovat předpokládaný mechanizmus, kterým vIRF3 zvyšuje transkripční aktivitu c-Myc a objasnit dříve nedefinovanou roli, jíž vIRF3 hraje při stimulaci ubiquitinace c-Myc a při regulaci jeho...
|
|
| |
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
Dynamika a mechanismus umlčování reportérového genu pro GFP v závislosti na aktivitě RDR6 a způsobu indukce RNA interference v buněčné linii tabáku BY-2
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent)
RNA interference (RNAi) je proces, který se u rostlin prostřednictvím malých RNA (sRNA = small RNA) významně podílí na regulaci genové exprese. Rozmanité dráhy RNAi lze rozdělit na dva základní mechanismy, a to posttranskripční a transkripční umlčování (PTGS a TGS). Vznik sRNA je vždy závislý na přítomnosti dvouvláknové molekuly RNA (dsRNA), která je štěpena některým z DCL proteinů za vzniku sRNA obvykle o délce 21 - 24 nt a jedno z vláken sRNA je následně rozpoznáno proteinem AGO. V případě PTGS interaguje komplex AGO- sRNA na základě komplementarity sekvence sRNA s cílovou RNA, kterou rozštěpí nebo zablokuje její translaci. U TGS reaguje AGO s rostlinně specifickou RNA Pol V a jejími transkripty, se kterými opět páruje vlákno sRNA nesené proteinem AGO. Tato interakce umožní sestavení komplexu proteinů, které indukují metylaci DNA a posléze i histonů, jež působí inhibičně na transkripci RNA Pol II. Způsobů, jakými může dsRNA vznikat, je celá řada. Velká část v buňce tvořených dsRNA je závislá na syntéze komplementárního vlákna do podoby dsRNA prostřednictvím RDR6 (RNA dependentní RNA polymeráza 6), která je zapojena i do procesu vzniku sekundárních sRNA. Význam RDR6 při PTGS byl zkoumán pomocí reportérového genu pro GFP, a to při samovolném umlčování a při umlčování vyvolaném třemi odlišnými...
|
|
|
Epigenetické mechanismy
Šornová, Veronika ; Černá, Marie (vedoucí práce) ; Koc, Michal (oponent)
Epigenetika je studium dědičných změn genové aktivity, které nejsou způsobeny změnou sekvence v DNA. Epigenetické mechanismy se mohou uplatnit na celé řadě úrovní, od transkripce až po translaci. Patří mezi ně metylace DNA, modifikace histonů, a s tím spojená modifikace chromatinu, a RNA interference. Výsledkem je změna konformace chromatinu vedoucí ke snížené nebo zvýšené expresi určitého genu, inaktivaci jednoho z chromosomů X nebo genovému imprintingu. Epigenetická regulace hraje důležitou roli v etiopatogenezi multifaktoriálních onemocnění. Na jejich vzniku se podílejí genetické predispoziční faktory (u autoimunitních chorob se jedná o geny hlavního histokompatibilního komplexu) a environmentální faktory, které působí na náš genom právě prostřednictvím epigenetických modifikací. Klíčová slova: Epigenetické mechanismy, metylace DNA, modifikace histonů, RNA interference, genomový imprinting, inaktivace chromozomu X, multifaktoriální onemocnění.
|
host ::
RSS.