|
|
Deconvolution fluorescence microscopy of yeast cells
Štec, Tomáš ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Název práce: Využití dekonvoluce v digitální fluorescenční mikroskopii kvasinek Autor: Tomáš Štec Katedra/ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jarmoír Plášek, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Fluorescenční mikroskopie představuje rychlou a levnou alternativu k po- kročilejším metodám zobrazování jako jsou konfokální a elektronová mikroskopie. Snímaný obraz je však zatížen velkou mírou zkreslení. Pomocí počítačového zpraco- vání obrazu - dekonvoluce, lze do značné míry eliminovat zkreslení obrazu, čím se umožní rekonstrukce třírozměrné podoby snímaných objektů. V této práci je pod- robně prozkoumána dekonvoluční procedura programu NIS Elements AR, která je následně aplikována na rekonstrukci třírozměrné podoby kvasinek Saccharomyces cerevisiae barvených calcofluorem, s cílem charakterizovat změny vzhledu bunkové stěny v průběhu stárnutí. S rostoucím věkem kvasinky se na povrchu objevují ne- rovnosti, ke konci života dochází i k praskání bunkové stěny. Klíčová slova: fluorescence, mikroskopie, dekonvoluce, NIS Elements AR, calcof- luor, kvasinky, bunková stěna, stárnutí
|
|
|
Conventional and Novel Functions of the Exocyst Complex in Plants
Kulich, Ivan ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Exocyst je oktamerický proteínový komplex, konzervovaný naprieč ríšou Eukaryota. Jeho úloha, pôvodne popísaná u kvasiniek, spočíva v pútaní sekretorických váčkov k plazmatickej membráne pred samotným splynutím dvoch membrán. Podjednotky exocystu SEC3 a EXO70 sú považované za tie, ktoré určujú miesto pútania váčku k plazmatickej membráne. Zatiaľ čo genóm kvasinky obsahuje jedinú podjednotku EXO70, u suchozemských rastlín ich nájdeme desiatky (23 u Arabidopsis). Táto práca sa zaoberá úlohou komplexu exocyst v rastlinnej bunke. Jej prvá časť dokladá, že exocyst sa významne podieľa na sekrécii komponentov bunkovej steny, obzvlášť pektínov, ale aj pri hrubnutí bunkovej steny vyvolanom interakciou s patogénom. Ďalšia časť odhaľuje novú, nekonvenčnú úlohu podjednotky EXO70B1 (a na nej založenom subkoplexu) pri autofagickom transporte do vakuoly a vyvoláva tak mnoho otáznikov nad rastlinnou sekretorickou dráhou a jej špecifikami.
|
|
|
Role of cytoskeleton in plant cell morphogenesis
Miklánková, Pavlína ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Sekereš, Juraj (oponent)
Bunky sú schopné nadobúdať nepreberné množstvo tvarov, v čom hrá dôležitú úlohu cytoskelet. Ovplyvňuje depozíciu materiálov bunečnej steny, reguluje pohyb vačkov po bunke, podieľa sa na exocytóze a endocytóze. Kortikálne mikrotubuly ovplyvňujú ukladanie celulózy do bunečnej steny a tým udávajú smer bunečnej expanzie, hoci presný súvis medzi mikrotubulami a celulózou zostáva nevyjasnený. Aktín podporuje rast a prispieva k jeho priestorovej regulácii vo vrcholovo aj difúzne rastúcich bunkách. Je dôležitý pri sekrécii v expandujúcich bunkách, ale jeho presné funkcie pri riadení bunečného rastu nie sú ešte celkom vysvetlené. Pre lepšie pochopenie, ako spolu súvisia aktínový a mikrotubulárny cytoskelet v morfogenéze rastlinných buniek, sa používajú analýzy mutantov, spektroskopické metódy, cytoskeletárne jedy, fluorescenčné proteíny a ďalšie metódy. Dobrým modelom pre výskum sú epidermálne a trichómové bunky Arabidopsis thaliana, na ktorých prebieha väčšina štúdii.
|
|
|
Specificity of selected exocyst subunits in trichome development
Glanc, Matouš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Trichomy jsou jemné struktury epidermálního původu, které pokrývají povrch nadzemních orgánů většiny rostlin. Jednobuněčné trichomy Arabidopsis thaliana jsou dobře zavedeným modelem v buněčné a vývojové biologii rostlin, přesto je o procesech ukládání buněčné stěny během finální fáze zrání trichomu známo jen velmi málo. V naší laboratoři byla nedávno objevena role podjednotky poutacího komplexu exocyst EXO70H4 při zrání trichomu. V této práci byly za použití analýzy obrazu, histochemického barvení a FT-IR spektroskopie studovány defekty v buněčné stěně u ztrátového mutanta exo70H4. Bylo zjištěno, že mutace vede ke změně v ukládání pektinu a možná též ligninu a hemicelulóz. Byly připraveny transgenní linie s paralogy EXO70 exprimovanými pod promotorem EXO70H4 a jejich analýza ukázala, že nejbližší paralog EXO70H3 dokáže komplementovat mutaci EXO70H4, na rozdíl od paralogů EXO70A1 a EXO70B1. Na základě těchto výsledků jsou diskutovány otázky týkající se složení buněčné stěny trichomů, role EXO70H4 ve zrání trichomu a funkcí komplexu exocyst u rostlin. Klíčová slova: Arabidopsis, trichom, buněčná stěna, sekreční dráha, komplex exocyst, EXO70H4, FT-IR spektroskopie
|
|
|
Vliv vysychání na streptofytní řasy - mechanismy stresové odolnosti
Pošmourný, Martin ; Pichrtová, Martina (vedoucí práce) ; Vosolsobě, Stanislav (oponent)
V této bakalářské práci jsem se věnoval odolnosti streptofytních řas proti vysychání. Přesto, že se této oblasti doposud věnovalo jen pár lidí, v posledních letech bylo na toto téma publikováno značné množství prací. Byly zjištěny zajímavé informace a objeveny nové skutečnosti. Výzkum pokračuje stále dál a tak by bylo užitečné se poohlédnout, na co všechno se přišlo. Věřím, že porozumění tomuto fenoménu je klíčové pro pochopení některých událostí ve vývoji přírody a uvědomění si, jak houževnatý dokáže život být na samých hranicích svého možného výskytu. Pokusil jsem se utřídit současné vědomosti o mechanismech stresové odolnosti streptofytních řas a doufám, že získaný přehled mi do budoucna pomůže lépe se v dané problematice orientovat. Doposud bylo pozorováno několik přístupů k obraně proti vysychání. Prevence vysušení, adaptace na nedostatek vody a tolerance úplného vyschnutí. Mezi preventivní způsoby obrany patří vytváření shluků buněk, kobercovitých porostů, či sekrece slizového obalu. Jako adaptaci na nedostatek vody řasy vyvinuly složitější odpovědi v podobě změn ultrastruktury, či regulaci fyziologických procesů. Např. Klebsormidium je schopné během půlhodiny nastartovat výrobu značného množství kalózy a zabudovat ji do buněčné stěny. Tím získá potřebnou pružnost, aby v důsledku rapidního...
|
|
|
Secretory pathway in plant cell wall polysaccharide biosynthesis and FT-IR spectroscopy methods in plant cell wall composition analysis
Glanc, Matouš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Votrubová, Olga (oponent)
Všechny rostlinné buňky jsou obklopeny buněčnou stěnou, která ustavuje jejich velikost a tvar a je nezbytná pro mnoho zásadních buněčných procesů. Buněčná stěna streptofytních rostlin je tvořena převážně vysokomolekulárními polysacharidy. Celulóza, hlavní složka buněčné stěny rostlin, je syntetizována transmembránovými proteinovými komplexy přímo na povrchu buňky, zatímco hemicelulózy a pektiny jsou tvořeny v Golgiho aparátu. Bylo popsáno několik proteinů účastnících se syntézy těchto polysacharidů, nicméně stovky dalších teprve čekají na objevení. Proteiny nutné pro syntézu celulózy a molekuly hemicelulóz a pektinů syntetizované v Golgiho aparátu jsou transportovány na povrch buňky sekreční drahou, tato dráha tedy hraje důležitou roli v biogenezi buněčné stěny. Hypotézy o regulaci sekrece komponent buněčné stěny počítají s působením aktinového a mikrotubulárního cytoskeletu, vápníkového gradientu nebo PIP kináz; komplexní regulace tohoto procesu však zdaleka není popsána. FT-IR spektroskopie je metoda schopná detekce molekulárních vibrací, s jejíž pomocí je možné získat informace o chemickém složení prakticky všech látek. Tato metoda je úspěšně používána v identifikaci mutantů s abnormální buněčnou stěnou, ve studiu interakcí mezi jednotlivými složkami buněčné stěny a v dalších experimentech...
|
|
|
Mechanismy polarizace epidermálních buněk rostlin.
Vojtíková, Zdeňka ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Soukup, Aleš (oponent)
Buňky rostlinné epidermis společně vytváří kontaktní plochu rostliny a chrání ji před vlivy vnějšího prostředí a zprostředkovávají komunikaci s okolím. V epidermis je za pomoci polarizačních mechanismů rovnoměrně rozmístěno několik buněčných typů (dlaždicové buňky, trichomy a průduchy) s velice specializovanou morfologií. Svých tvarů dosáhnou díky polarizovanému růstu, který je zajištěn cytoskeletem a signalizačními molekulami z rodiny ROP GTPáz. Cytoskelet v odpovědi na signál ovlivňuje rozpínání buňky, napomáhá zacílit sekreci do míst aktivního růstu a polarizovaně zabudovávat nový materiál do buněčné stěny. Na svrchní straně epidermis se vylučuje kutikula a vrstva epikutikulárních vosků. Sekrece složek kutikulárních vrstev je baso-apikálně polarizovaná. V této práci jsou shrnuty doposud objevené mechanismy polarizace v buňkách epidermis rostlin.
|
|
|
Visualization of root apoplastic pH in plants
Wernerová, Daša ; Fendrych, Matyáš (vedoucí práce) ; Paris, Nadine (oponent)
Orientované pohyby rostlin neboli tropismy umožňují rostlinám aktivně reagovat na různé podněty z prostředí a získat tak více světla, lepší přístup k výživě nebo zajistit růst kořenů hlouběji do půdy. Gravitropismus orientuje růst kořene podél vektoru gravitace. Gravitace je vnímána prostřednictvím sedimentace statolitů v kořenové čepičce, nicméně přesná signální dráha není zatím známa. Gravitropní stimulus vyvolává nerovnoměrnou redistribuci fytohormonu auxinu ve vnějších vrstvách buněk, která vede k rozdílnému růstu na vrchní a spodní straně kořene a způsobuje tak jeho ohnutí. Změny v redistribuci auxinu jsou doprovázeny změnami v pH apoplastu. Odhalení přesné povahy těchto změn by mohlo pomoci objasnit mechanismy signální dráhy v odpovědi na gravitropismus. Pro přesné měření pH mohou být využívány mikroelektrody, nejsou však vhodné pro dlouhodobé měření pH v rostoucích kořenech. V posledních letech se objevila různá pH senzitivní barviva a geneticky kódované senzory. Tyto mohou být použity pro dlouhodobé detekování změn pH v rostoucích kořenech in vivo. V předkládané práci jsem porovnala několik publikovaných pH senzitivních geneticky kódovaných senzorů a dostupných barviv v kořenech Arabidopsis thaliana. U pH senzitivních barviv jsem pozorovala značnou variabilitu v citlivosti detekce pH a...
|
|
|
FUNCTIONAL ANAYSIS OF SELECTED EXO70 EXOCYST SUBUNITS IN PLANTS
Kubátová, Zdeňka ; Kulich, Ivan (vedoucí práce) ; Grossmann, Guido (oponent) ; Lichtscheidl-Schultz, Irene (oponent)
Unikátnost trichomů Arabidopsis thaliana tkví ve spojení jejich jednobuněčnosti a specifického tvaru, a tak jsme trichomy využili jako skvělý modelový systém pro výzkum mechanismů buněčné polarizace. Vývoj rostlinného těla je silně určen mechanismy buněčné polarizace a proteinový komplex exocyst je jed- ním z jejich klíčových regulátorů. Exocyst je tvořen osmi různými podjednotkami a při polarizované exo- cytóze váže sekretorické váčky na cílové membráně. Podjednotka EXO70 pomocí interakce s fosfolipidy značí konkrétní místo exocytózy na cílové membráně. Pozoruhodné zmnožení genů podjednotky EXO70 v rostlinných genomech je již obstojně zdokumentováno, nicméně zmapování funkční rozrůzněnosti jed- notlivých paralogů zatím schází. Studiem trichomů jsme odhalili specifickou funkci paralogu EXO70H4 ve vývoji sekundární bu- něčné stěny trichomu a především sekreci kalózo-syntáz. V divokém trichomu jsme popsali utváření tlus- té sekundární buněčné stěny během fáze dozrávání a její absenci u mutanta exo70H4. Dále jsme prokázali vztah mezi ukládáním křemíku a přítomností kalózy. Také jsme odhalili rozdělení plazmatické mem- brány trichomu na apikální a bazální doménu plazmatické membrány, které se liší složením fosfolipidů a schopností vázat různé paralogy EXO70. Naše výsledky mají potenciál širšího využití...
|
|
|
Study of yeasts transglycosylases
Čurillová, Natália ; Ing.Hana Schusterová, Ph.D. (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
This study is interested in properties of fungal transglycosylases, specifically Phr1, Phr2 and Crh2. These enzymes are involved in the remodelling of yeast cell walls due to their cleavage of structural donor polysaccharides and transfer of their fragments to the other acceptor (poly)saccharide molecules. The mammalian cells do not contain cell walls, nor cell wall transglycosylases, that´s why these enzymes are possible targets for antifungal agents. In this diploma thesis the effect of 67 commercially available inhibitors on Phr1 and Phr2 enzymes was studied by rapid screening. In the case of the Phr1 enzyme, two inhibitors showed a potential effect which was subsequently tested by size exclusion chromatography column incorporated into HPLC device. None of the inhibitors were found to have an inhibitory effect on Phr1 or Phr2 enzymes in contrast to DMSO in which all inhibitors were dissolved. The mode of action of Phr enzymes was also studied by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. The first method allowed to monitor the formation of products only in the later stages of the reaction, but more sensitive size exclusion chromatography showed the product formation at the beginning of the reaction. Phr1 cleaved the donor substrate near the non-reducing end and forms small fragments that are transfered to labeled acceptors during the whole reaction. Phr2 utilized random action pattern, thus creating products with higher molecular weight from the beginning of reaction. The effect of the polymerization degree of acceptor on it´s affinity with the Crh2 was also studied. The Michaelis-Menten constants showed no effect of acceptor lenght on the affinity between enzyme and substrate.
|
host ::
RSS.