|
|
Biomarkery neurodegenerace v séru a mozkomíšním moku u pacientů s vybranými neurologickými onemocněními
Nosková, Libuše ; Fialová, Lenka (vedoucí práce) ; Tlaskalová - Hogenová, Helena (oponent) ; Švarcová, Jana (oponent)
Neurofilamenta jsou základní strukturní komponentou cytoskeletu neuronů, kde plní řadu funkcí. Skládají se ze 3 podjednotek: lehký řetězec (NfL); střední řetězec (NfM) a těžký řetězec (NfH). Tyto podjednotky jsou ještě doplněny α-internexinem v centrální nervové soustavě (CNS) nebo peripherinem v periferní NS. Vlivem různých patofyziologických procesů dochází ke zvýšenému uvolňování neurofilament do extracelulárního prostoru, kde mohou interagovat se složkami imunitního systému. Vzhledem k zapojení imunitního systému do patogeneze neurodegenerativních onemocnění a menší míře znalostí o protilátkové odpovědi na neurofilamenta, je vhodné tyto informace co nejvíce rozšířit. Stanovení volných neurofilament doplněné o analýzu protilátek proti jednotlivým podjednotkám a jejich vytvořených imunokomplexů poskytuje širší pohled na tuto problematiku. Optimalizovali jsme metody ELISA pro stanovení volných protilátek proti lehkým a těžkým řetězcům neurofilament spolu s odpovídajícími imunokomplexy pro analýzu v séru i mozkomíšním moku. Zavedení metodiky na stanovení protilátek proti lehkému a těžkému řetězci neurofilament a odpovídajících imunokomplexů je předpokladem pro analýzu uvedených parametrů v séru a mozkomíšním moku u pacientů s neurodegenerativním onemocněním. Protilátky proti těžkému řetězci...
|
|
|
CFTR-mRNA: alternativa pro genovou terapii cystické fibrózy
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je onemocnění, u kterého dochází k mutaci CFTR genu kódujícího stejnojmenný protein, jehož hlavní funkcí je přenos chloridových iontů. K napravení tohoto defektu byla v rámci diplomové práce vybrána genová terapie. Byly syntetizovány dva typy stabilní mRNA obsahující minimálně 200 adeninů na 3' konci, 25 % pseudouridinu, 25 % 5-methylcytidinu a na 5' konci buďto klasickou čepičku (enzymová mRNA) nebo analog čepičky 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (tzv. ARCA mRNA). Byly použity buněčné linie od zdravých jedinců (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou s mutací F508del (CuFi-1). Vizualizace CFTR proteinu pomocí optimalizované metody nepřímé imunofluorescence potvrdila zvýšení exprese CFTR proteinu u obou buněčných linií CuFi-1 a NuLi-1, a to jak při použití ARCA mRNA tak při použití enzymové mRNA. Funkčnost CFTR proteinu byla stanovena prostřednictvím fluorescenčního barviva N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), kterým byly buněčné linie předem obarveny a které je specificky zhášeno halogenovými ionty. Transport iontů skrze tento kanál byl ověřen použitím CFTR(inh)-172, který specificky tento kanál inhibuje svou vazbou na R doménu. Po 24h transfekci ARCA mRNA buněčné linie CuFi-1 došlo k obnově jeho funkce. V neposlední řadě byla studována adheze bakterií Pseudomonas...
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium bakteriální adheze na plicní epitel pacientů s CF
Nosková, Libuše ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Švédová, Martina (oponent)
Cystická fibróza (CF) je geneticky podmíněné onemocnění nesoucí sebou řadu zdravotních komplikací. Hlavní komplikací je chronická kolonizace a infekce dýchacích cest pacientů specifickými mikroorganismy - zejména Pseudomonas aeruginosa. Právě infekce plic tímto mikroorganismem je nejčastější příčinou smrti pacientů s cystickou fibrózou. Ke kolonizaci dýchacích cest dochází prostřednictvím řady adhezivních struktur jako je například lektin PA-IIL. V současné době je nejpoužívanější terapií léčba antibiotiky, ale vzhledem ke vzniku rezistencí jsou hledány i jiné způsoby léčby. Jednou z možností je pasivní imunizace pacientů pomocí slepičích protilátek. Pro tento účel byly připraveny protilátky proti jedné z adhezivních struktur P. aeruginosa, proti rekombinantnímu lektinu PA-IIL. Tyto protilátky rozpoznávaly i nativní lektin Pa- IIL exprimovaný bakterií P. aeruginosa. Pro testování schopnosti protilátek zabránit adhezi bakterií na buňky plicního epitelu bylo třeba vyvinout vhodný modelový systém. Byly připraveny základní komponenty systému, epiteliální buňky a bakterie P. aeruginosa. Z dýchacích cest CF pacientů byly izolovány buňky 2 metodami - izolací přímo z tkáně a technikou "brushing". K vyhodnocení adhezních testů byl hledán vhodný objektivní způsob vyhodnocení založený na vizualizaci...
|
|
|
Možné přístupy k terapii cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je genetické onemocnění způsobené mutací v CFTR genu. To má za následek absenci či špatnou funkčnost CFTR chloridového kanálu, který je i zásadním regulátorem dalších iontových kanálů. Tato práce se zaměřila na studium genové terapie cystické fibrózy pomocí genového přenosu CFTR-mRNA. K určení exprese CFTR proteinu bylo použito metod nepřímé imunofluorescence a Western blot imunodetekce. Zároveň byla stanovena relativní míra genové exprese CFTR genu pomocí kvantitativní PCR. K experimentům byly použity buněčné linie zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu s homozygotní mutací F508del (CuFi-1) a zárodečného ledvinného epitelu (HEK293S). CFTR protein byl vizualizován uvedenými metodami pomocí šesti primárních protilátek (432, 450, 570, 596, 769, CF3). Pro detekci CFTR proteinu pomocí metody nepřímé imunofluorescence byly jako nejvhodnější vybrány primární protilátky 570 a CF3. V případě metody Western blot byla pro detekci uvedeného proteinu vhodná pouze protilátka CF3. Stanovením relativní míry genové exprese CFTR genu bylo zjištěno, že tento gen je exprimován u studovaných buněčných linií v malém množství, přičemž míra jeho exprese je v buněčné linii CuFi-1 přibližně šestkrát vyšší než v buněčné linii NuLi-1. Byla zkoumána též účinnost transfekce buněčné linie CuFi-1...
|
|
|
Interakce bakteriálních lektinů s epitelem lidských plic
Vyhnalová, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Recesivní autozomální onemocnění cystická fibróza (CF) je způsobena mutací v genu CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"), který kóduje stejnojmenný chloridový kanál. Tato mutace vede k nesprávnému transportu iontů, což má za následek tvorbu nadměrně viskózního hlenu na povrchu dýchacích cest, a následně ke zvýšené náchylnosti k bakteriálním onemocněním. Právě infekce dýchacího systému jsou nejčastější příčinou úmrtí pacientů s CF. Jedním z nejnebezpečnějších patogenů pro tyto pacienty je Pseudomonas aeruginosa (PA), bakterie, která ke své patogenitě využívá řadu faktorů virulence, jako jsou pili nebo adheziny. Lektin PA-IIL, ze skupiny adhezinů PA, se vyznačuje vysokou afinitou k L-fukose, takže přispívá k adherenci PA na málo sialylovaný epitel pacientů s CF. V této práci byly zkoumány interakce mezi PA-IIL a plicním epitelem. Byly využity buněčné linie CuFi-1 (pacient s CF) a NuLi-1 (zdravý jedinec), které byly zkoumány ex vivo. Část těchto linií byla vystavena působení neuraminidasy. Lektin PA-IIL byl izolován z buněčné linie E. coli pET25_PAIIL a následně fluorescenčně značen DyLight 488. Aktivita zmíněného lektinu byla ověřena pomocí aglutinace červených krvinek. Postup značení nezměnil vazebnou afinitu lektin-sacharid. Interakce mezi lektinem a buněčnými liniemi byly...
|
|
|
Vývoj antibakteriálních protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Vašková, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Autozomálně recesivní onemocnění cystická fibrosa (CF) způsobené mutacemi genu CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator") vede k absenci či defektům CFTR proteinu s funkcí chloridového kanálu. Pro toto onemocnění je typická zejména náchylnost k bakteriálním infekcím dýchacího ústrojí z důvodu hromadění zahuštěného hlenu a pozměněné glykosylace v plicích. Tyto infekce nejčastěji způsobuje bakterie Pseudomonas aeruginosa (PA), k jejíž patogenitě přispívá i lektin PA-IIL. Tento lektin má vysokou afinitu k L-fukose a patří mezi adhesiny PA. Tato práce je zaměřena na studium vlivu anti-PA-IIL protilátek izolovaných z vaječných žloutků a multivalentních inhibitorů PA-IIL na bázi fukosy na adherenci PA k buňkám plicního epitelu. Protilátky byly izolovány z vaječných žloutků slepice před a po imunizaci lektinem PA-IIL. Specifické anti-PA-IIL protilátky byly získány afinitní chromatografií na koloně s imobilizovaným PA-IIL. Metodou ELISA byla ověřena schopnost těchto protilátek rozpoznat PA-IIL. Přítomnost PA-IIL v bakteriální kultuře Pseudomonas aeruginosa (PAK, ST 1763) a schopnost protilátek rozpoznat tento bakteriální lektin byla ověřena pomocí metody Western blot s následnou imunodetekcí. Byly též zjištěny vhodné podmínky kultivace pro expresi tohoto lektinu. Vliv protilátek na adhezi...
|
|
|
Studium interakce lektin-protilátka pomocí povrchové plasmonové rezonance
Zákopčaník, Marek ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je autozomálně recesivní onemocnění, které postihuje zejména europoidní rasu. Je způsobeno mutacemi v CFTR genu, které vedou k poruchám funkce stejnojmenného iontového kanálu. Nejvíce je zasaženo dýchací ústrojí, jelikož změnou podmínek plíce ztrácí přirozenou obrannou funkci a stávají se tak náchylné k bakteriálním infekcím, které jsou nejčastější příčinou úmrtí pacientů s CF. Mezi tyto bakterie se řadí mimo jiné Burkholderia cepacia, která u pacientů s CF způsobuje velmi rychlou degradaci plicní tkáně. Boj s touto bakteriální infekcí komplikuje řada rezistencí vůči antibiotikům a tvorba biofilmu. Potenciálním prostředkem prevence bakteriálních infekcí plic pacientů s CF jsou slepičí protilátky proti bakteriálním lektinům. S využitím afinitní chromatografie na koloně s imobilizovaným lektinem BC2L-A byla získána frakce specifických protilátek. Imunoreaktivita směsné protilátky, afinitně purifikované protilátky a nezachycené frakce byla porovnána metodou ELISA. Z porovnání imunoreaktivity vychází, že došlo k zakoncentrování specifických protilátek více než 10×. Dále byla studována interakce lektin-protilátka pomocí metody SPR. V prvním uspořádání byla měřena síla vazby aktivního lektinu na glykosylace protilátek obsažených v nezachycené frakci. Disociační konstanta této interakce...
|
|
|
Možné přístupy k terapii cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je genetické onemocnění způsobené mutací v CFTR genu. To má za následek absenci či špatnou funkčnost CFTR chloridového kanálu, který je i zásadním regulátorem dalších iontových kanálů. Tato práce se zaměřila na studium genové terapie cystické fibrózy pomocí genového přenosu CFTR-mRNA. K určení exprese CFTR proteinu bylo použito metod nepřímé imunofluorescence a Western blot imunodetekce. Zároveň byla stanovena relativní míra genové exprese CFTR genu pomocí kvantitativní PCR. K experimentům byly použity buněčné linie zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu s homozygotní mutací F508del (CuFi-1) a zárodečného ledvinného epitelu (HEK293S). CFTR protein byl vizualizován uvedenými metodami pomocí šesti primárních protilátek (432, 450, 570, 596, 769, CF3). Pro detekci CFTR proteinu pomocí metody nepřímé imunofluorescence byly jako nejvhodnější vybrány primární protilátky 570 a CF3. V případě metody Western blot byla pro detekci uvedeného proteinu vhodná pouze protilátka CF3. Stanovením relativní míry genové exprese CFTR genu bylo zjištěno, že tento gen je exprimován u studovaných buněčných linií v malém množství, přičemž míra jeho exprese je v buněčné linii CuFi-1 přibližně šestkrát vyšší než v buněčné linii NuLi-1. Byla zkoumána též účinnost transfekce buněčné linie CuFi-1...
|
|
|
Genová terapie cystické fibrózy
Baráčková, Petra ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutacemi genu CFTR ("Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"). Jedná se o nejčastější genetické onemocnění v bělošské populaci. V současnosti postihuje přibližně 75 000 jedinců světové populace. CF jakožto monogenní porucha představuje vhodný cíl pro léčbu pomocí genové terapie. Od sekvenování CFTR genu v roce 1989 bylo provedeno velké množství preklinických a klinických studií zkoumajících nejrůznější principy této terapie. Cílem předkládané práce bylo provést souhrn dosavadních poznatků a představit nejnovější strategie genové terapie cystické fibrózy, které představují slibný základ pro definitivní vyléčení tohoto onemocnění. Stále se vyvíjející technologie z oblasti genomového inženýrství, prohlubující se znalosti o patogenezi choroby a dosavadní výsledky preklinických a klinických studií motivují vědce k dalšímu testování nových přístupů genové terapie, které by odstranily příčiny této nemoci a trvale ji vyléčily pomocí zásahu do lidského genomu. Klíčová slova: cystická fibróza, CFTR gen, CFTR protein, genová terapie
|
|
|
Protilátky proti lektinu PA-IIL jako prostředek prevence bakteriálních infekcí u pacientů s cystickou fibrosou
Vašková, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibrosa je autozomálně recesivní onemocnění způsobené mutací genu CFTR, která vede k poškození stejnojmenného proteinu s funkcí iontového kanálu. V důsledku poškození dochází k narušení rovnováhy elektrolytů. Nejvíce je postiženo dýchací ústrojí, kde dochází k zahuštění hlenu a ke změnám v glykosylaci povrchových struktur buněk plicního epitelu. Výše uvedené změny vedou k nedostatečné obranné funkci plic a větší náchylnosti k bakteriálním infekcím. Nejčastějším patogenem dýchacích cest pacientů s CF je Pseudomonas aeruginosa. Tato bakterie obsahuje řadu virulentních faktorů a má schopnost tvořit biofilm, který ji chrání před obrannými mechanismy hostitele a účinky antibiotik. Léčba antibiotiky je navíc komplikovaná vznikem rezistencí. Slepičí protilátky vykazují značný potenciál jako prostředek prevence bakteriálních infekcí plic u pacientů s CF. Efekt specifických a nespecifických protilátek na adherenci kontrolního kmenu Pseudomonas aeruginosa (PAK, ST 1763) ex vivo byl sledován na modelovém systému buněčných linií plicních epiteliálních buněk od pacienta s CF (CuFi-1) a zdravého jedince (NuLi-1). Bakteriální a plicní buňky byly značeny fluorescenčními barvivy PKH, vyhodnocení bylo prováděno spektrofluorimetricky. Bylo ověřeno, že slepičí protilátky proti PA-IIL mají schopnost specificky...
|
host ::
RSS.