|
|
Bakteriální toxiny působící na biologických membránách
Benešová, Anna ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Sýkora, Jan (oponent)
Kolicin E1 je dlouho studovaný bakteriální toxin patřící mezi tzv. pórotvorné koliciny. Mechanismus jeho působení spočívá v tvorbě póru v cytoplazmatické membráně citlivé bakterie příbuzné produkčnímu kmeni vedoucí k depolarizaci membrány a smrti buňky. Koliciny obecně lze považovat za prostředek boje o zdroje mezi příbuznými kmeny Escherichia coli a dalších Enterobacteriaceae. Nedávno se objevila hypotéza, že kolicin E1 neslouží k zabíjení příbuzných bakterií, ale je produkovaný uropatogenními kmeny Escherichia coli k zabíjení buněk močových cest. Dosud byly zřejmě vlastnosti kolicinu E1 popisovány nepřesně, dohromady s jeho jinou sekvenční variantou - nově pojmenovaným kolicinem E11. Kolicin E11 se podle hypotézy mohl vyvinout jako prostředek boje s ostatními bakteriemi střevní mikrobioty. Cílem této diplomové práce bylo porovnat pórotvorné vlastnosti kolicinu E1 a E11 pomocí měření na planárních lipidových membránách a liposomech různého lipidového složení. Z výsledků vyplývá, že oba koliciny tvoří póry podobného charakteru, co se týká jejich vodivosti. Zároveň jsou póry obou kolicinů slabě kation selektivní. Testování aktivity kolicinů na liposomech ukázalo vyšší aktivitu kolicinu E1 oproti kolicinu E11 na membránách napodobujících složením nejen savčí buňky, ale i cytoplazmatickou membránu...
|
|
|
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP.
Mašková, Kateřina ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP Extracelulární lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu pouze jednu serin/threoninovou proteinkinázu eukaryotního typu (StkP) a příslušnou PP2C fosfatázu (PhpP), proto je unikátním modelovým organismem pro studium signalizačních drah u bakterií. Dosud bylo identifikováno a charakterizováno několik substrátů těchto signalizačních proteinů, mezi které patří například proteiny DivIVA, KhpB, FtsA, FtsZ, MacP, GlmM, GpsB, ComE a další. Jedná se o proteiny, které se účasní různých buněčných procesů, včetně buněčného dělení a syntézy peptidoglykanu. Pomocí globální fosfoproteomové studie založené na LC-MS analýze bylo zjištěno, že jedním z identifikovaných proteinů je hypotetický protein Spr1962, jehož fosforylace byla detekována pouze v hyperfosforylovaném kmeni s odstraněnou fosfatázou PhpP. Cílem této práce byla charakterizace nového substrátu Spr1962 a objasnění jeho možné funkce. Vzhledem k významné strukturní podobnosti s flotilinovým proteinem bakterie Bacillus subtilis FloT bylo navrženo, že by se mohlo jednat o protein s analogickou funkcí u pneumokoka. Bylo zjištěno, že odstranění tohoto genu způsobuje fenotyp zvětšených buněk na různých genetických pozadích. Sledováním...
|
|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Vztah struktury syntetických organických molekul, jejich chování ve fosfolipidové membráně a působení na bakterie
Brzobohatá, Hana ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Mašín, Jiří (oponent)
Lipofosfonoxiny (LPPO) jsou organické molekuly modulární struktury s baktericidní aktivitou, která se uskutečňuje na membráně tvorbou pórů. Vykazují slibné hodnoty MIC (minimální inhibiční koncentrace) i HC50 (hemolytická koncentrace). Řadí se mezi syntetická antimikrobiální peptidomimetika, tedy látky, které neobsahují peptidické řetězce, ale napodobují strukturu membránově aktivních oligopeptidů. Tato práce se zabývá popisem antimikrobiálních vlastností molekul DR 7072, DR 34P1, DR 362 a DR 236, které se řadí mezi tzv. LEGO-LPPO (IV. generace LPPO). Vybrané molekuly se liší ve struktuře hydrofobního modulu (HM), délce spojovacího modulu (SM), nebo v obojím. Testované molekuly vykazovaly slibné hodnoty MIC (mezi 2 a 16 μg/ml) a byla potvrzena jejich schopnost permeabilizovat membránu gram negativních (G- ; Pseudomonas aeruginosa) i gram pozitivních (G+ ) bakterií (Staphylococcus aureus). Molekuly vykazují rozdílný mechanizmus účinku proti zmíněným bakteriím. Na G+ bakterie působí rychleji a v nižších koncentracích. Příčinou tohoto rozdílu může být rozdílné fosfolipidové složení cytoplazmatické membrány nebo přítomnost vnější membrány u G- baterií, což odpovídá výsledkům v této práci. LEGO-LPPO tvoří v membráně neselektivní nebo anion selektivní póry a způsobují lyzi lipozómů. Molekula DR 362 tvoří...
|
|
|
Nekovalentní interakce tryptofanu ve struktuře proteinu
Sokol, Albert ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Jurkiewicz, Piotr (oponent)
Dokonalá znalost nekovalentních interakcí aminokyselin uvnitř proteinové struktury je esenciální pro úplné pochopení jeho konformace, stability a funkce. Mezi všemi aminokyselinami, které obvykle tvoří protein, se tryptofan vyjímá jednak svojí vzácností, ale také velikostí postranního řetězce tvořeného indolovou skupinou. Ta je schopna zajišťovat různé typy nepostradatelných interakcí uvnitř proteinu, mezi různými polypeptidovými řetězci, ale také třeba mezi proteinem a biologickou membránou. Navíc se jedná o nejčastěji využívaný přirozený bílkovinný fluorofor. Ke studiu aminokyselinových interakcí se běžně využívají databáze vyřešených proteinových struktur, nad kterými se vytváří více či méně komplexní analýzy. Takto již byly nalezeny mnohé nekovalentní interakce, které mohou mezi tryptofanem a ostatními aminokyselinami nastávat. Většina těchto analýz se ale soustřeďuje na studium konkrétní interakce a nezabývá se prostředím tryptofanu jako celku, kde se všechny aminokyseliny vzájemně ovlivňují. Pomocí nově vytvořených postupů jsou v této práci analyzovány profily výskytu jednotlivých aminokyselin okolo indolové skupiny tryptofanu a výsledky porovnány s dostupnou literaturou. Aminokyselina, která má největší preferenci k tryptofanu, se ukázala být opět tryptofan a tyto dvojice tryptofanů jsou...
|
|
| |
|
| |
|
|
Bakteriální toxiny translokující přes plazmatickou membránu eukaryotických buněk
Poledňák, Jan ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Žáčková Suchanová, Jiřina (oponent)
Bakteriální proteinové toxiny schopné translokace přes plazmatickou membránu jsou důležitými prvky virulence bakterií způsobujících onemocnění eukaryotickým organismům. Toxiny translokují své vlastní domény s toxickou aktivitou nebo vytvoří pór, kterým mohou procházet další molekuly od iontů až po DNA, RNA nebo proteiny. Pozorováním přenosu těchto a dalších uměle připravených látek na molekulární úrovni je možné zkoumat vlastnosti pórotvorných toxinů. Některé z těchto toxinů byly natolik podrobně charakterizovány, že mohou být po cílené mutagenezi naopak využity pro výzkum přenášených molekul. Jednou z takových aplikací je měření průchodu nukleotidů i celých vláken nukleových kyselin přes membránový kanál vytvářený α-hemolysinem S. aureus. Tato metoda si v současné době našla uplatnění při sekvenaci DNA.
|
|
|
Studium struktury a funkce IRES elementů v kvasinkových buňkách
Černý, Jiří ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Iniciace translace je důležitý krok v regulaci buněčné exprese. Translace většiny buněčných mRNA je zahajována klasickým mechanizmem závislým na přítomnosti 7mG čepičky. Existují však mRNA, které jsou překládány alternativním mechanizmem využívajícím přítomnost IRES elementů v 5'UTR takovýchto mRNA. V první části své diplomové práce jsem se pokusil potvrdit přítomnost IRES elementů v 5'UTR z kvasinkových genů BAS1 a RRN3. Tyto 5'UTR jsem vložil do intercistronické oblasti na plazmidu pFGAL4h a změřil jsem aktivitu reportérových proteinů v systému s a bez promotoru. Data ukázala přítomnost kryptického promotoru v testovaných sekvencích. Abych tato data potvrdil, vložil jsem 5'UTR z genu RRN3 do intercisronické oblasti na plazmidu pRFh a změřil expresi druhého cistronu. Výsledky získané tímto měřením se podobaly výsledkům, které jsem získal za využití plazmidu pFGAL4h. Přítomnost kratších RNA přepisovaných z kryptického promotoru, který se nachází v intercistronické oblasti, jsem dokázal pomocí real time PCR. Mým úkolem v druhé části této práce bylo připravit sadu RNA vhodných ke studiu iniciace translace zahajované na lasovité čepičce, která vzniká činností autokatalytického ribozymu GIR1 v hlence Didymium iridis. Za tímto účelem jsem připravil širokou sadu rekombinantních molekul DNA, které nesly různé...
|
|
|
Působení genotoxického 2-nitrofluorenu a jeho metabolitů na DNA in vivo a možnosti výzkumu tohoto působení pomocí elektrochemických DNA biosenzorů in vitro
Stávková, Klára ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Předkládaná bakalářská práce se zaměřuje na problematiku nebezpečného 2-nitrofluorenu (NF), který je jedním z markerů výskytu nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků. Shrnuje dosavadní poznatky o vzniku tohoto xenobiotika, jeho výskytu a koloběhu v životním i pracovním prostředí a negativních účincích na živé organismy, především pak na jejich DNA. Tyto poznatky z in vivo studií jsou v předkládané bakalářské práci porovnány s informacemi získanými pomocí elektrochemických DNA biosenzorů, které představují velmi slibnou in vitro alternativu studia dějů probíhajících v živých organismech při interakci xenobiotik s jejich DNA. NF se do ovzduší uvolňuje převážně výfukovými plyny z dieslových i benzínových motorů. Adsorbuje se na pevné prachové částice, pomocí kterých se rozšiřuje na velké vzdálenosti a vstupuje do dýchacích cest živočichů. Atmosférickým spadem přechází NF do vody a půdy, kde je spolu s dalšími živinami a potravou přenášen do rostlin a živočichů a jejich konzumací se poté dostává do těl vyšších živočichů i člověka. Bylo ukázáno, že NF je chemicky stabilní látkou, avšak v organismu podléhá intenzivnímu metabolismu. Metabolity vykazují mutagenní i karcinogenní účinky. Nejnebezpečnějším se jeví 2-acetylaminofluoren. Váže se na DNA a vytváří s ní DNA adukty, které mohou iniciovat...
|
host ::
RSS.