|
|
Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery
Kamanová, Jana ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent) ; Černý, Jan (oponent)
(Czech) 6 SUMMARY (Czech) První část této dizertační práce se věnuje molekulárnímu mechanismu působení adenylát-cyklázového toxinu (CyaA). Tento protein z rodiny RTX toxinů je sekretovaný gramnegativní bakterií Bordetella pertussis, která způsobuje infekční onemocnění nazývané černý kašel. CyaA hraje klíčovou roli ve schopnosti tohoto patogena kolonizovat sliznice horních cest dýchacích a to díky schopnosti potlačovat baktericidní funkce myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému hostitele. CyaA se váže na integrin CD11b/CD18 (označovaný také jako CR3 nebo αMβ2) těchto buněk, vytváří v jejich buněčných membránách malé kation-selektivní kanály, a dopravuje do jejich cytozolu N-koncovou adenylát- cyklázovou (AC) doménu. Ta je po svém průniku do buněčného cytozolu aktivována navázáním eukaryotického kalmodulinu a katalyzuje velmi efektivní přeměnu ATP na cAMP, jednu z klíčových molekul buněčné signalizace. Tím dochází v napadených buňkách k nárůstu hladiny cAMP, což vyvolá rychlou ztrátu schopností fagocytózy pomocí Fc-receptorů a oxidativního vzplanutí těchto buněk. CyaA má unikátní schopnost přenášet svou AC doménu do cytozolu buněk přímo z cytoplazmatické membrány. Celý proces je velmi pravděpodobně poháněn membránovým potenciálem, a vyžaduje strukturní integritu a kooperaci všech domén RTX...
|
|
| |
|
|
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk
Potůčková, Lucie ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Holáň, Vladimír (oponent)
9 2 ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena především na pochopení regulační úlohy C- terminální Src kinázy (CSK) a proteinu asociovaného s mikrodoménami bohatými na glykosfingolipidy (PAG) v FcɛRI zprostředkované signalizaci myších žírných buněk. FcɛRI aktivace je zahájena agregací receptoru komplexem multivalentního antigenu s IgE a následnou aktivací protein tyrozin kináz, protein tyrozin fosfatáz a dalších molekul signální transdukce. Signalizační děje vedou k degranulaci žírných buněk a uvolnění prozánětlivých mediátorů zodpovědných za vznik alergických onemocnění. Poznání funkce klíčových regulačních molekul, které kontrolují FcɛRI zprostředkovanou aktivaci, degranulaci a cytokinovou produkci žírných buněk, může mít terapeutický dopad. CSK je hlavním negativním regulátorem protein tyrozin kináz z rodiny Src (SFK), které hrají kritickou úlohu v různých imunoreceptorových dějích. Funkce CSK v žírných buňkách však není zcela objasněna. Předpokládá se, že CSK lokalizovaná v cytoplazmě je translokována do blízkosti membránově vázaných SFK s využitím membránových adaptorových proteinů a PAG byl hlavním kandidátem. Pro určení úlohy proteinů CSK a PAG v FcɛRI signalizaci jsme jako model použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) myší divokého typu nebo myší deficientních v proteinu PAG...
|
|
|
Molecular mechanisms of regulation of FcɛRI signaling in mast cells
Bambousková, Monika ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Bilej, Martin (oponent)
SOUHRN Žírné buňky tvoří důležitou součást imunitního systému. Při patologických situacích jsou aktivovány a jsou zodpovědné za alergické reakce. Detailní poznání molekulárních mechanismů vedoucích k jejich aktivaci je proto důležité zejména pro vývoj nových postupů v léčbě alergických reakcí. Nejdůležitějším transmembránovým receptorem žírných buněk je vysokoafinitní Fc receptor pro IgE (FcεRI). FcεRI váže IgE na plasmatické membráně. Po prokřížení polyvalentním antigenem, imunoreceptorové tyrosinové aktivační motivy (ITAM) v intracelularní části receptrou jsou fosforylovány a spouští se signální dráha vedoucí k buněčné aktivaci. Signalizace přes FcεRI po vazbě antigenu je kriticky závislá na interakci s intracelularními protein-tyrosinovými kinasami, které zprostředkovávají fosforylaci ITAM motivů, a zároveň na mnoha dalších komponentách signalizační dráhy. Tato práce byla soustředěna na studium signalizačních procesů vedoucích k aktivaci žírných buněk na několika různých úrovních s důrazem na rané fáze signalizace přes FcεRI. Nejprve jsme se zaměřili na roli protein-tyrosinových fosfatas (PTP) při inicializaci fosforylace FcεRI. Podařilo se nám ukázat, že aktivace FcεRI antigenem vede k oxidaci tyrosinu v aktivním místě PTP a tudíž k jejich inhibici. Topografie inaktivních PTP na plasmatické membráně...
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Dráber, Petr (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology
Polakovičová, Iva ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato dizertační práce se zaměřuje především na pochopení regulačních úloh transmembránových adaptorových proteinů NTAL ("non-T cell activation linker") a PAG ("phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains") v aktivaci myších žírných buněk. V odborné literatuře existují protikladné studie o úloze proteinu NTAL v aktivační dráze vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI). Studie prováděné na žírných buňkách připravených z myší s genovým knockoutem NTALu naznačují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI signalizace, zatímco experimenty provedené na lidských žírných buňkách a buňkách bazofilní leukemie potkana s potlačenou expresí proteinu NTAL mu připisují pozitivní regulační roli. Abychom pochopili zapojení proteinu NTAL v FcεRI zprostředkované signalizaci v myších žírných buňkách a určili, zda různé metodiky delece NTALu mají různé fyziologické následky, použili jsme široké spektrum testů. Jako model jsme použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) a připravili jsme BMMC z myší NTAL divokého typu ("wild type") a myší s genovým knockoutem NTALu. Pomocí lentivirových vektorů jsme transdukovali část buněk divokého typu vektorem nesoucím NTAL shRNA ("short hairpin RNA") pro generování buněk s potlačenou expresí NTALu ("knockdown") nebo prázdným...
|
|
|
Regulation of mast cell activation at the level of the high-affinity IgE receptor and STIM1
Bugajev, Viktor ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato disertační práce je zaměřena na dva důležité regulátory signalizace žírných buněk. Prvním z nich je komplex vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI), který se podílí na získaných (adaptivních) imunitních odpovědí a druhý je stromální interakční molekula 1 (STIM1), která monitoruje hladiny vápníku v endoplasmickém retikulu (ER) a po uvolnění Ca2+ z ER se podílí na otevření vápníkovým uvolněním aktivovaných vápníkových (CRAC) kanálů. I když je struktura FcεRI známá již mnoho let a byla popsána řada molekul asociovaných s tímto receptorem, přesný molekulární mechanismus zahájení a ukončení FcεRI signalizace zůstává nejasný. V této studii jsme vyhodnotili dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech iniciace fosforylace FcεRI s důrazem na nově popsaný model, podle kterého vzájemné interakce mezi protein tyrosin fosfatázami (PTPs) a protein tyrosin kinázami (PTKs) nastaví práh tyrosinové fosforylace FcεRI (PTK-PTP interakční model). Dále jsme rozšířili poznatky týkající se topografie fosfatáz citlivých k oxidaci po stimulaci FcεRI v rámci klastrů transmembrálních adaptorových proteinů: T buňky neaktivující "linker" (NTAL) a "linker" aktivovaných T lymfocytů (LAT). Žírné buňky původem z kostní dřeně (BMMC) jsme použili jako modelový systém pro získání nových poznatků o...
|
|
|
Regulatory functions of the transmembrane adaptor protein NTAL in activation of mast cells
Tůmová, Magda ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
SOUHRN Žírné buňky pocházejí z kmenových buněk kostní dřeně. Tyto buňky necirkulují v krvi, ale nachází se v celé řadě tkání, kde jsou často umístěny v blízkosti cév. Žírné buňky jsou součástí přirozeného imunitního systému, ale zároveň ovlivňují i adaptivní imunitní systém a také se účastní alergických a zánětlivých reakcí. Žírné buňky mají na svém povrchu vysokoafinitní receptor pro IgE (FcεRI). Prokřížení tohoto receptoru spouští kaskádu reakcí, která vede k uvolnění předpřipravených a nově syntetizovaných efektorových molekul. Časné fáze aktivace těchto buněk zahrnují tyrosinovou fosforylaci četných substrátů a formování signálních komplexů (v angl. "signalosomes"). Důležité strukturní prvky těchto komplexů jsou transmembránové adaptorové proteiny. Jedním takovým proteinem je adaptorový protein NTAL (Non-T cell Activation Linker), který je velmi rychle fosforylován na tyrosinových zbytcích po prokřížení FcεRI a který slouží jako pozitivní, ale i negativní regulátor signálních drah FcεRI. Abychom byli schopni studovat podrobnou topografii proteinu NTAL a dalších molekul plazmatické membrány u žírných buněk odvozených z kostní dřeně (BMMC), nejprve jsme vyvinuli novou metodu izolace listů plazmatické membrány neadherentních buněk. Tato metoda je založena na adsorpci buněk k ultračistému mikroskopickému...
|
|
|
Úloha metabotropních glutamátových receptorů a proteinů, které s nimi interagují, ve fyziologické signalizaci a v patologii
Kumpošt, Jiří ; Blahoš, Jaroslav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent) ; Viklický, Vladimír (oponent)
Glutamát, který je hlavním excitačním přenašečem v mozku savců, aktivuje jak ionotropní receptory tak metabotropní glutamátové receptory. Ionotropní receptory jsou zodpovědné za rychlý synaptický přenos vedoucí k depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do buňky. Metabotropní glutamátové receptory přes heterotrimerní G-proteiny modulují glutamátovou signalizaci pomocí modulace řady signálních drah. Postsynapticky lokalizované receptory z 1. skupiny mGlu receptorů (mGluR1,5) spolu s ionotropními NMDA a AMPA receptory sdílejí společný "signalosom", tedy soubor molekul, které ovlivňují, nebo se přímo účastní signalizace glutamátových receptorů. Napojení na signalosom se liší u sestřihových variant mGluR1 včetně napojení na "scaffold" proteiny, jako je PSD-95, organizující proteiny postsynaptické denzity. Heterodimerizace mGluR1 ve smyslu sestřihových variant je ústředním tématem této práce spolu se studiem role nedávno objeveného proteinu IL1RAPL1 (interleukin-1 receptor accessory protein-like 1) v organizaci postsynaptického signalosomu. mGluR1 má u člověka minimálně dvě sestřihové varianty - mGluR1a a mGluR1b. Pomocí biochemických, imunocytochemických a funkčních testů jsme ukázali, že v heterologním expresním systému jsou heterodimery mGluR1a/1b povrchově exprimované a že tyto receptory...
|
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
host ::
RSS.