|
|
Studium isotopicky značených látek v živých buňkách pomocí Ramanovy mikroskopie
Bura, Radek ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Pilát, Zdeněk (oponent)
Jednobuněčné řasy (mikrořasy) jsou schopny produkovat řadu látek, jako jsou škroby, oleje, proteiny, karotenoidy, polyfosfáty nebo krystalické puriny přímo z anorganických zdrojů pomocí fotosyntézy. Různé druhy mikrořas je možno využít pro ekonomicky výhodnou produkci různých biomolekul. Díky autotrofnímu charakteru jsou mikrořasy výjimečné i v tom, že mohou syntetizovat složité isotopicky značené biomolekuly z jednoduchých isotopicky značených anorganických látek. Analýza chemického složení mikrořas pomocí chemicko-analytických metod je poměrně složitá, časově náročná a pracná. Mezi optické metody, pomocí kterých lze určit chemické složení mikrořas in situ, tj. přímo v intaktních buňkách, patří konfokální Ramanova mikroskopie. Tato technika, kombinující konfokální optickou mikroskopii s Ramanovou spektroskopií, umožňuje rychlou a nedestruktivní analýzu chemického složení látek ve zkoumaných objektech, a to včetně vlivu isotopického značení. Odrazem chemického složení objektů jsou Ramanova spektra, v případě Ramanova mapování mikroskopických objektů pak jejich chemické mapy. V této práci byl studován specifický případ isotopického značení, a to vliv těžké vody (D2O) na deuteraci biomolekul v živých buňkách mořské řasy Amphidinium carterae. Hlavním tématem byla detekce různě deuterovaných forem krystalického...
|
|
|
Fotogenerace singletního kyslíku verteporfinem
Laubrová, Veronika ; Dědic, Roman (vedoucí práce) ; Mojzeš, Peter (oponent)
Fotodynamická terapie je metoda, pomocí které lze léčit řadu onemocnění, např. onkologická onemocnění. Základem této metody je likvidace nemocné tkáně singletním kyslíkem získaným přenosem energie z fotosenzibilizátorů, mezi něž patří i verteporfin. Experimentální část této práce zkoumá absorpční a fluorescenční spektra verteporfinu pro různé koncentrace. Dále byly z kinetik luminiscence singletního kyslíku pro různé koncentrace získány doby života singletního kyslíku a tripletů verteporfinu a jejich závislost na koncentraci vzorku. Ze závislosti dob života singletního kyslíku na koncentraci verteporfinu byla určena zhášecí konstanta. Ze srovnání měření ve vzorku v rovnováze se vzduchem a s čistým kyslíkem byla určena zhášecí konstanta tripletů verteporfinu rozpuštěným kyslíkem.
|
|
|
Konformační přechody a stabilita kvadruplexů nukleových kyselin
Johanovská, Zuzana ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Profant, Václav (oponent)
Práce se zabývá studiem guaninových kvadruplexů, tj. nekanonickými čtyřvláknovými strukturami nukleových kyselin bohatých na repetitivně guaninové sekvence s potenciálně biologickým a nanotechnologickým významem. První část shrnuje základní informace o struktuře a topologii kvadruplexů, ve druhé části jsou pak uvedené poznatky o kvadruplexech in vivo. Třetí část je věnována metodám, užitým při vlastním měření, konkrétně Ramanově spektroskopii, cirkulárnímu dichroismu a absorpční spektroskopii. Následující části se věnují měření a zpracování vlastních experimentálních výsledků. V rámci práce bylo zkoumáno pět sekvenčně blízkých oligonukleotidů odlišujícími se pouze bázemi v jednočlenných smyčkách. Byl zkoumán vliv koncentrace oligonukleotidu a draselných iontů K+ na stabilitu těchto kvadruplexů pomocí Ramanovy spektroskopie, přičemž byla pozorována neobvykle vysoká termální stabilita. Další experimenty zahrnovaly měření CD a absorpčních spekter za nižších koncentrací oligonukleotidů, dvou různých koncentrací draselných iontů a porovnání stability jednotlivých modifikací s publikovanými výsledky. Dále byla studována možná interakce s kationickým porfyrinem CuTMPyP4, podobná interakci s antiparalelním kvadruplexem TBA. Interakce s paralelnímu kvadruplexy však prokázána nebyla, potvrzen byl naopak vliv...
|
|
|
Termodynamika tvorby komplexů miRNA
Vacková, Anežka ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Mojzeš, Peter (oponent)
Práce se týká mikroRNA (miRNA), což jsou krátké řetězce RNA, které svou vazbou na cílovou mRNA molekulu regulují expresi genetické informace. Vzniklé komplexy miRNA a mRNA mají zpravidla podobu neúplného duplexu, kde jsou krátké úseky Watson-Crickových bázových párů přerušovány vnitřními smyčkami, nekomplementárními páry nebo výdutěmi. Obsahem práce je studium vlivu anomálních strukturních útvarů, vnitřní smyčky a výdutě, na strukturní stabilitu komplexu tvořeného miRNA označované Let7 s jejím cílovým úsekem LCS1 na mRNA lin-41 z Caenorhabditis elegans. Řešení práce spočívalo ve změření teplotních závislostí UV absorpčních spekter směsných roztoků výše uvedených RNA sekvencí a jejich mutovaných analog a v analýze spektrálních změn pomocí metody singulárního rozkladu a následným fitováním s použitím termodynamického modelu. Výsledkem jsou určené termodynamické charakteristiky komplexů a spektrální změny spojené se zvýšením teploty komplexu a s jeho rozpadem.
|
|
|
Raman microspectroscopy of living cells and biological tissues
Moudříková, Šárka ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Matthäus, Christian (oponent) ; Samek, Ota (oponent)
Název práce: Ramanova mikrospektroskopie živých buněk a biologických tkání Autorka: Šárka Moudříková Katedra / ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí disertační práce: doc. RNDr. Peter Mojzeš, CSc., Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Abstrakt: Ramanova mikroskopie kombinuje Ramanovu spektroskopii s optickou konfokální mikroskopií a poskytuje tak informace o chemickém složení vzorku s prostorovým rozlišením v řádu µm3 . V této práci byla metoda Ramanovy mikroskopie použita pro studium mikroskopických řas, jednobuněčných fotosyntetických organismů, které jsou jedním ze základních pilířů pozemské biosféry a využití nacházejí i v biotechnologických aplikacích. Ramanova mikroskopie fotosyntetických organismů se musí vypořádat s vysokým a nežádoucím spektrálním pozadím, které je tvořené fluorescencí buněčného fotosyntetického aparátu. V této práci byla proto nejprve vyvinuta metoda rychlého a spolehlivého potlačení tohoto pozadí pomocí fotovybělení fotosyntetických pigmentů. Díky tomu jsme mohli studovat vnitrobuněčnou distribuci buněčných komponent - proteinů, škrobu, lipidů a polyfosfátu. Vývoj těchto struktur v průběhu buněčného cyklu jsme studovali u modelové řasy druhu Desmodesmus quadricauda. Dále jsme vyvinuli metodu pro kvantifikaci polyfosfátu v buněčné kultuře řas druhu Chlorella vulgaris. U...
|
|
|
Studium mikrokrystalických inkluzí v jednobuněčných řasách pomocí Ramanovy mikroskopie
Suja, Matyáš ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Šloufová, Ivana (oponent)
Mnoho jednobuněčných řas, ať už sladkovodních, suchozemských nebo mořských, obsahuje různé mikrokrystalické inkluze, které následně využívají při svém životním cyklu. Analýza molekulárního složení těchto inkluzí je však pomocí řady fyzikálně-chemických metod velmi obtížná a často také náchylná k mnoha artefaktům měření. U mnoha jednobuněčných řas proto nebylo složení těchto mikrokrystalů vůbec určeno nebo může být stanoveno chybně. Mezi vhodné metody, schopné určit složení mikrokrystalických tělísek uvnitř jednobuněčných řas s vysokou přesností, patří mimo jiné i Ramanova konfokální mikroskopie. Tato v poslední době velmi perspektivní metoda optické vibrační spektroskopie umožňuje rychlou a nedestruktivní analýzu molekulového složení zkoumaných objektů. Ramanova mikroskopie nevyžaduje chemickou extrakci, modifikaci ani jiné značení nebo barvení měřených vzorků a lze jí proto bez problémů použít přímo na živé buňky v různých fázích přirozeného vývoje. Výsledné chemické složení pozorované látky je charakterizováno odpovídajícím Ramanovým vibračním spektrem. Cílem této diplomové práce je zjištění přítomnosti mikrokrystalů ve vybraných jednobuněčných řasách různých fylogeneticky odlišných druhů, studium podmínek jejich výskytu a identifikace jejich skutečného chemického složení pomocí Ramanovy mikroskopie.
|
|
|
Polyfosfáty v jednobuněčných řasách: sledování jejich hromadění a vnitrobuněční lokalizace pomocí Ramanovy mikroskopie
Suja, Matyáš ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Kočišová, Eva (oponent)
Fosfor se hojně využívá v zemědělství, neboť podporuje růst pěstovaných plodin a zvyšuje tak výnosnost půdy. S rostoucí světovou populací se ale dramaticky zvyšuje spotřeba tohoto prvku, přičemž jeho světová naleziště jsou konečná a očekává se jejich vypotřebování v následujících několika desetiletích. Je proto důležité nalézt efektivní způsob recyklace fosforu, který by v budoucnu mohly představovat právě jednobuněčné mikroskopické řasy. Řasy jsou totiž schopné z okolního prostředí vstřebávat nadměrná množství fosforu, který ukládají mimo jiné ve formě polyfosfátů. Polyfosfáty jsou vysokoenergetické biomolekuly, které se vyskytují v buňkách rostlinné i živočišné říše, kde hrají klíčovou roli v řadě životně důležitých procesů. Pro studium metabolizmu a distribuce polyfosfátů na buněčné úrovni lze použít Ramanovu mikroskopii, která umožňuje efektivní analýzu živých buněk bez nutnosti jejich speciálních úprav před měřením. Předmětem této bakalářské práce byl rozvoj metodologie potřebné pro studium akumulace polyfosfátů a jejich vnitrobuněční lokalizace v mikroskopických řasách pomocí Ramanovy mikroskopie.
|
|
|
Studium struktury guaninových kvadruplexů pomocí neresonanční Ramanovy spektroskopie
Golan, Martin ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Mašek, Vlastimil (oponent)
Úseky lidských telomerových sekvencí obsahující alespoň 4 guaninové subsekvence jsou schopny formovat konformačně variabilní intrastrandové kvadruplexy. Dřívější studie využívající konvenční Ramanovu spektroskopii uvádí, že sekvence G3(TTAG3)3 o milimolárních koncentracích ve fosfátovém pufru s přidanými ionty Na+ o iontové síle 150 mM zaujme antiparalelní konformaci bez ohledu na délku stání vzorku či jeho annealing, kdežto ionty K+ vedou k postupnému přechodu do "3+1", případně paralelní konformace. Výsledky měření sekvence AG3(TTAG3)3 taktéž o milimolárních koncentracích pomocí tzv. Photonic Crystal Fibre-enhanced Raman Spectroscopy (PCFRS) naopak udávají, že v přítomnosti sodíku i v přítomnosti draslíku (iontová síla roztoků 100 mM) se po dvoudenním stání vytvoří struktura paralelní. Tato práce zkoumá sekvenci AG3(TTAG3)3 metodami konvenční Ramanovy spektroskopie a Ramanovy spektroskopie kapkově nanášených povlaků v rozsahu koncentrací od jednotek do stovek milimolů v oligodeoxyribonukleotidech. Dochází k závěru, že struktura ve fosfátovém pufru s ionty Na+ je antiparalelní i navzdory dlouhému stání a annealingu, kdežto v přítomnosti draselných iontů je a zůstane v konformaci "3+1". Byly navrženy dvě hypotézy o příčině rozdílů mezi výsledky získanými pomocí PCFRS a konvenční Ramanovy spektroskopie:...
|
|
|
Ramanova mikrospektroskopie a mapování jednotlivých buněk
Gregorová, Šárka ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Ramanova mikrospektroskopie umožňuje měřit spektra Ramanova rozptylu s prostorovým rozlišením v řádu μm3 a studovat tak neinvazivním způsobem přirozené složení biologických objektů jako jsou tkáně, jednotlivé buňky a buněčné organely. V předkládané práci byly pomocí Ramanovy mikrospektroskopie studovány vakuoly oportunisticky patogenní kvasinky druhu Candida albicans. Byly naměřeny rozsáhlé série Ramanových spekter vakuol při různých způsobech kultivace buněk. K vyhodnocení souborů Ramanových spekter byla využita vícerozměrná statistická metoda rozkladu do singulárních hodnot (singular value decomposition). Spektrální analýza umožnila charakterizaci chemického složení vakuol. Bylo zjištěno, že vakuoly buněk kultivovaných různým způsobem či v různých kultivačních médiích se mezi sebou liší zejména obsahem polyfosfátu, reprezentovaného ve spektru úzkým pásem s maximem okolo 1155 cm-1 . Až o několik cm-1 se může překvapivě lišit též poloha maxima tohoto pásu na vlnočtové škále. Na základě experimentů provedených in vitro s hexametafosfátem sodným coby modelem vakuolárního polyfosfátu bylo navrženo, že poloha maxima tohoto pásu je významně ovlivněna koncentrací dvojmocných kationtů.
|
|
|
Biologically important non-canonical structures of nucleic acids in complexes with cationic porphyrins
Palacký, Jan ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Setnička, Vladimír (oponent) ; Víglaský, Viktor (oponent)
Guaninové kvadruplexy tvoří třídu neobvyklých konformací nukleových kyselin založených na stohování guaninových tetrád stabilizovaných prostřednictvím Hoogsteenovského párování a koordinace kationtů. Podílejí se celé řadě buněčných procesů včetně replikace, rekombinace nebo transkripce. Guaninové kvadruplexy jsou velmi rozšířené v lidském genomu, ale nejvíce se vyskytují v jednovláknových oblastech telomer bohatých na guanin. O telomerní guaninové kvadruplexy roste zájem díky jejich schopnosti inhibovat aktivitu enzymu telomeráza, který je zodpovědný za proliferaci nádorových buněk. Konkrétně jsme zkoumali konformační polymorfismus základní lidské telomerní sekvence G3(TTAG3)3 vyvolaný koncentrací DNA, kovových kationtů (K+ , Na+ ) a/nebo teplotní renaturací. Ramanova spektroskopie byla použita jako primární metoda pro toto studium, neboť, na rozdíl od běžných spektroskopických metod, jsme mohli sledovat strukturu kvadruplexu za velmi vysokých koncentrací DNA napodobujících podmínky molekulárního shlukování v buňce. Ukazujeme, že kvadruplex G3(TTAG3)3 přechází mezi antiparalelním a paralelním uspořádáním řetězců v závislosti na koncentraci DNA a iontů K+ . Kromě toho také ukazujeme, že kationické porfyriny mohou sloužit jako citlivé sondy konformace kvadruplexů. Závěrem diskutujeme možnou dimerizaci...
|
host ::
RSS.