|
| |
|
| |
|
|
Úloha Na+/H+ antiporterů plasmatické membrány ve fyziologii kvasinkových buněk
Papoušková, Klára ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Flachs, Pavel (oponent)
Souhrn _____________________________________________________________________________________________________________ 60 5. SOUHRN Souhrn _____________________________________________________________________________________________________________ 61 Nejdůležitější výsledky získané v rámci této disertační práce, která přispěla k porozumění fyziologické roli kvasinkových Na+ /H+ antiporterů plasmatické membrány, je možno shrnout do těchto bodů: 1. Studium kvasinkových Na+ /H+ antiporterů na úrovni jejich sekvencí (publikace č. 1) ukázalo, že struktura všech tří skupin antiporterů (Nha1, Nhx1 i Kha1) pravděpodobně obsahuje 12 transmembránových segmentů, v sekvencích proteinů jsme nalezli některé konzervované aminokyseliny či motivy, jež by mohly být významné pro aktivitu antiporterů, a námi provedená fylogenetická studie ukázala, že proteiny Nhx1 jsou příbuzné savčím a rostlinným Na+ /H+ antiporterům, proteiny Kha1 se zdají být nejpříbuznější s bakteriálními antiportery a Na+ /H+ antiportery plasmatické membrány (rodina Nha1) tvoří oddělenou vývojovou větev, jejíž představitelé byli doposud charakterizováni jen v houbových organismech. 2. Gen DhNHA1 kvasinky D. hansenii kóduje Na+ /H+ antiporter plasmatické membrány se širokou substrátovou specifitou (publikace č. 2). Tento protein se tedy může v D. hansenii...
|
|
|
Heat-induced stress granules of Saccharomyces cerevisiae.
Groušl, Tomáš ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Sychrová, Hana (oponent)
(česky) Jedna ze základních charakteristik živých organismů je snaha adaptovat se na měnící se životní podmínky. Regulace translace poskytuje rychlý a široce použitelný mechanismus pro realizaci stresem indukovaných změn. Komplexy mRNA molekul a asociovaných proteinů, které se účastní translace a dalších procesů spojených s mRNA molekulami, podléhají vlivem stresu strukturním změnám. Tyto změny mohou vést k akumulaci zmíněných komplexů do struktur vyššího řádu, jako jsou stress granules (stresové granule) nebo processing bodies. O dalším osudu mRNA molekul a některých součástí translačního aparátu buňky za stresu, se rozhoduje prostřednictvím právě těchto akumulací. Ve snaze detailně porozumět úloze stresových granulí v buněčném metabolismu, jsme v naší laboratoři blíže analyzovali teplem indukované stresové granule kvasinkového modelového organismu Saccharomyces cerevisiae. Zjištěním, že se stresové granule tvoří také v tomto jednobuněčném eukaryotickém organismu, jsme přispěli k poznání, že fenomén stresových granulí je evolučně konzervovaný napříč eukaryotickou říší. Teplem indukované stresové granule kvasinky S. cerevisiae se podobají stresovým granulím evolučně vyšších eukaryot složením a v navrhovaných metabolických funkcích. Nicméně, tyto granule jsou také v některých ohledech jedinečné a...
|
|
|
Biochemická a molekulární podstata specifických vlastností nekonvenčních osmotolerantních kvasinek
Dušková, Michala ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Jednobuněčné organismy jako například kvasinky jsou neustále vystavovány měnícímu se okolnímu prostředí, zvláště pak změnám koncentrace osmoticky aktivních látek. Kvasinkové druhy schopné čelit těmto měnícím se podmínkám lépe, jsou považovány za osmotolerantní (Zygosaccharomyces rouxii, Pichia sorbitophila, Debaryomyces hansenii, apod.). Osmotolerance kvasinek závisí na řadě fyziologických parametrů, ale nejdůležitější vlastností je účinný metabolismus tzv. vnitřních osmolytů. Tuto úlohu zastupuje ve většině kvasinkových druhů malá molekula glycerolu. Při hypoosmotickém stresu se kvasinky zásob glycerolu zbavují, při adaptaci na vysoký osmotický tlak (hyperosmotický stres) naopak glycerol syntetizují a akumulují. Modelová Saccharomyces cerevisiae má dva transportní systémy pro glycerol, kanál ScFps1 sloužící především pro vypouštění glycerolu v případě hypoosmotických podmínek a současně také přenašeč ScStl1 akumulující glycerol v průběhu hyperosmotického stresu. V rámci této práce byly nejprve detailně studovány fyziologické vlastnosti tří výše zmíněných nekonvenčních osmotolerantních druhů. Bylo zjištěno, že i přestože se tyto druhy příliš neliší od modelové S. cerevisiae v základních morfologických vlastnostech, jejich rozdílnost spočívá především ve schopnosti přežívat vysychání, vyrovnávat se...
|
|
|
Fyziologické úlohy Na+/H+ antiporterů v kvasinkách
Zahrádka, Jaromír ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Pichová, Iva (oponent)
3 Abstrakt Kvasinky Saccharomyces cerevisiae patří k důležitým modelům při studiu homeostase iontů alkalických kovů. Stejně jako v jiných buňkách je pro S. cerevisiae nezbytné udržení určité koncentrace K+ uvnitř buněk, na druhou stranu Na+ a další ionty alkalických kovů jsou pro buňky toxické. K+ je akumulován pomocí uniporterů Trk1 a Trk2, zatímco export toxických iontů alkalických kovů, a také nadbytečného K+ , je zajištěn ATPasami Ena, Na+ (K+ )/H+ antiporterem Nha1 a K+ selektivním kanálem Tok1. Ačkoli jsou jednotlivé transportery poměrně dobře prozkoumány, není dosud mnoho známo o celkové regulaci homeostase iontů alkalických kovů ani o vzájemné interakci a regulaci mezi jednotlivými transportery. V rámci této práce byl studován antiporter Nha1 a jeho fyziologické úlohy v kontextu ostatních transporterů iontů alkalických kovů. Ukázalo se, že nejen Nha1p, ale také další exportery, ATPasy Ena a kanál Tok1, jsou, přes jejich výraznou odlišnost v mechanismu transportu i způsobu regulace, regulovány společně změnou aktivity importerů K+ a to prostřednictví membránového potenciálu. Vzájemná regulace a funkční propojení importerů a exporterů K+ , ale také další výsledky poprvé ukázaly, jak velice důležitá je neustálá cirkulace K+ , tedy současný vstup a výstup K+ , pro udržování homeostase iontů alkalických...
|
|
|
Charakterizace a funkční analýza genu IST2 v kvasince Saccharomyces cerevisiae.
Andršová, Markéta ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Hlaváček, Otakar (oponent)
IST2 je znám jako gen kódující v modelové kvasince Saccharomyces cerevisiae membránový protein, který je studován díky jedinečnému způsobu transportu buňkou, během něhož zřejmě není vůbec využívána klasická sekreční dráha. Přestože gen byl pojmenován před více než deseti lety podle fenotypu buněk s jeho delecí (Increased Sodium Tolerance), dodnes není známo, jakým způsobem produkt genu IST2 ovlivňuje toleranci buněk k toxickému sodíku. Naše rešerše v databázích ukazuje, že podobný protein je kódován i v genomech ostatních druhů kvasinek, žádný však nebyl zatím studován. V této práci byla připravena série čtyř nových kmenů s delecí IST2 v genetickém pozadí lišícím se přítomností genů kódujících transportní systémy pro akumulaci draslíku (Trk1, Trk2), pro export nadbytečných draselných kationtů (Tok1, Ena1-5, Nha1) a pro export toxických kationtů lithia a sodíku (Ena1-5, Nha1). Dále byl připraven plazmid nesoucí kódující sekvenci genu IST2. Pomocí fenotypových testů na pevných i v tekutých médiích byl studován účinek delece IST2 v různých genetických pozadích. Bylo zjištěno, že IST2 zřejmě nemá úlohu v osmotoleranci obecně (absence fenotypu delece ve vysokých koncentracích KCl), ale jeho přítomnost negativně ovlivňuje schopnost buněk vypořádat se s vysokými koncentracemi toxických solí sodíku a...
|
|
|
Studium mechanismů produkce amoniaku u kvasinkových kolonií a tekutých kultur
Strachotová, Dita ; Váchová, Libuše (vedoucí práce) ; Sychrová, Hana (oponent) ; Gášková, Dana (oponent)
Kvasinky jsou jednobuněčné mikroorganismy, na pevném podkladu jsou však schopny vytvářet organizované struktury, kolonie, které mohou v jistých ohledech připomínat mnohobuněčné organismy. Při sledování vývoje kvasinkových kolonií v čase bylo zjištěno, že kolonie periodicky mění pH svého okolí z acidického na alkalické a naopak. Přepnutí z acidické do alkalické fáze je spojeno s produkcí amoniaku, který funguje jako signál mezi sousedními koloniemi. Data z analýz využívajících DNA čipy a další experimentální data nasvědčují, že za produkci amoniaku do okolí by mohly být zodpovědné tři homologní proteiny kódované geny ATO1 (YNR010c, ADY2), ATO2 (YNR002c, FUN34) a ATO3 (YDR384c). Cílem této práce je prohloubení znalostí jak o amoniakové signalizaci mezi kvasinkovými buňkami, tak o možných exportérech amonného kationtu - Ato proteinech. Práce přináší poznatky o dalších těkavých látkách - methylaminu a propylaminu - které jsou (vedle amoniaku) schopny indukovat vstup kvasinkové kolonie do alkalické fáze vývoje. Z hlediska amoniakové signalizace dále popisuje významný vliv transportu karboxylových kyselin na průběh vývoje kvasinkové kolonie, kdy omezený transport těchto slabých organických kyselin do buněk vybraných delečních kmenů patrně znemožňuje správný průběh amoniakové signalizace a diferenciace...
|
|
|
Studium činnosti mikrobiálních MDR-pump pomocí fluorescenčních sond: stanovení účinku potenciálních inhibitorů
Kodedová, Marie ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Höfer, Milan (oponent) ; Sychrová, Hana (oponent)
Nadměrné používání antimykotik v posledních letech vedlo ke vzniku rezistence vůči těmto látkám. Tudíž je zapotřebí vývoj nových antimykotik s různými mechanismy účinku, které by překonaly mnohačetnou lékovou rezistenci (MDR). Výhodou povrchově aktivních látek je jejich nízká toxicita pro hostitele a malá pravděpodobnost vzniku lékové rezistence. V disertační práci jsme vyvinuli metodu využívající potenciometrickou fluorescenční sondu diS-C3(3), substrát dvou hlavních MDR pump S. cerevisiae, Pdr5p a Snq2p. Pomocí této vysoce citlivé fluorescenční metody můžeme v reálném čase sledovat změny jak v aktivitě obou pump, tak v membránovém potenciálu. Díky ní můžeme efektivně vyhledávat inhibitory MDR pump s minimálními vedlejšími účinky na integritu plazmatické membrány a porovnávat efektivitu různých inhibitorů. Nové účinné inhibitory MDR pump by mohly být používány společně s antimykotiky, jež jsou substráty MDR pump. Metoda může být využita také ke stanovení mechanismu účinku povrchově aktivních látek a jejich nejnižších účinných koncentrací.
|
|
|
Plasma-membrane alkali-metal-cation transporters involved in salt tolerance of pathogenic Candida species
Krauke, Yannick ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
of Ph.D. Thesis Conclusions All the aims of the thesis were achieved. The tolerance to alkali metal cations of four pathogenic Candida species was studied in detail and revealed differences among the yeasts. These differences in sall tolerance remained the same under various growth conditions. For the first time, the internal sodium and potassium concentrations of several Candida species were estimated under high salt-stress grolvth. The internal K./Na* ratio was not in relation with the salt tolerance revealing different adaptation mechanisms to salt stress in Candida species. A first study on combinatory use of fluconazole and NaCl revealed severe synergistic effects of both compounds, leading to grovvth inhibition and increased internal Na* concentrationsi n C. albicans.T he molecularb asis of this synergismr emains to be established. Ihe C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapsilosis Cnhl NalH- antiporters were cloned and functionally characterized upon heterologous expression in S. cerevlslae to understand the mechanisms involved in the different salttolerances of Candida species. The three antiporters differed in their activity for alkali metal cations, which roughly correlated with the observed differences in salt tolerance among the species. Additionally, during the characterization of...
|
host ::
RSS.