|
|
Využití HPLC a LC-MS/MS metod v diagnostice dědičných metabolických poruch
Bártl, Josef ; Jelínek, Ivan (vedoucí práce) ; Čabala, Radomír (oponent) ; Cvačka, Josef (oponent)
V rámci této disertační práce byly vyvinuty a optimalizovány metody kapalinové chromatografie (HPLC) a tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) a následně využity pro diagnostiku dědičných metabolických poruch. První tematický okruh popisuje zavedení komplexního laboratorního postupu pro diagnostiku pacientů s dědičnou xanthinurií využívající kvantifikaci klíčových biochemických markerů a stanovení aktivity enzymu v plazmě. Pro tyto účely byla zavedena HPLC metoda s detekcí diodového pole pro kvantifikaci hypoxanthinu, xanthinu, allopurinolu a oxypurinolu v moči a plazmě a metoda pro stanovení pterinu a isoxanthopterinu v plazmě využívající HPLC separaci a detekci látek fluorimetrickým detektorem. Tyto metody byly úspěšně aplikovány v klinické praxi při diagnostice dvou pacientů s xanthinurií I. typu. Druhý tematický okruh je věnován vývoji a klinické aplikaci LC-MS/MS metody pro kvantitativní stanovení celkového homocysteinu (tHcy), methioninu (Met) a cystathioninu (Cysta) v suché krevní kapce a plazmě. Bylo prokázáno, že tato metoda dokáže detekovat pacienty s homocystinurií a zároveň rozlišit na základě koncentračních poměrů jednotlivých analytů, zda je porucha v transsulfurační či remethylační části metabolismu homocysteinu. Díky jednoduchému odběru a transportu vzorku suché krevní kapky...
|
|
|
Centrální inzulínová signalizace a fosforylace Tau proteinu u potkaního modelu diabetu 2. typu
Kasperová, Barbora Judita ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Mládková, Jana (oponent)
Diabetes mellitus 2. typu (DM2) a Alzheimerova nemoc (AN) jsou jedny z nejzávažnějších nemocí naší doby. Právě DM2, spolu s obezitou a nedostatkem pohybu jsou jedny z nejrizikovějších faktorů vedoucí k poruchám kognitivních funkcí a rozvoji demence. Při rozvoji AN dochází k patologickým změnám v mozku. Dochází ke vzniku nerozpustných extracelulárních plaků amyloidního beta peptidu a hyperfosforylaci proteinu Tau. Tato bakalářská práce studuje inzulínovou signalizační kaskádu a fosforylaci proteinu Tau v hipokampech 12ti týdenních ZDF (Zucker Diabetic Fatty) potkanů, zvířecím modelu DM2, v brzkém věku života. Z inzulínové signalizační kaskády bylo detekováno signifikantně nižší množství inzulínového receptoru v hipokampech ZDF potkanů ve srovnání s kontrolami. U ostatních kinas této kaskády (PDK-1, Akt) nebyl nalezen rozdíl jak v celkovém, tak fosforylovaném/aktivovaném proteinu v hipokampech ZDF potkanů a kontrol. Rovněž u fosforylace/aktivace kinas proteinu Tau (GSK-3β, ERK, JNK) a fosforylace/aktivace proteinu Tau na několika epitopech (Ser396, Thr212, Thr231) nebyly pozorovány žádné signifikantní rozdíly mezi ZDF potkany a kontrolami. V hipokampech 12ti týdenních ZDF potkanů, ačkoliv silně hyperglykemických a obézních, nebyly zaznamenány změny v efektivitě inzulínové signalizační kaskády ani...
|
|
|
Vývoj analytických metod pro stanovení fosforylovaných složek bakteriálních buněčných membrán
Mikulecká, Jana ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent)
Fosfolipidy jsou dominantními komponentami bakteriálních buněčných membrán, v nichž tvoří fosfolipidové dvojvrstvy. Bakterie se liší svým fosfolipidovým složením, což umožňuje stanovení a identifikaci významných skupin mikroorganismů. Lze však sledovat i změnu fosfolipidového zastoupení u bakterií stejného druhu, protože složení je ovlivněno celou řadou environmentálních podmínek. K identifikaci a stanovení bakteriálních fosfolipidů se běžně využívá tenkovrstvá chromatografie zejména pro svou minimální instrumentaci. Nevýhodou této metody je časová náročnost a požadavky na pečlivost a zručnost pracovníka. Rostoucí zájmem o fosfolipidové dvojvrstvy napomáhá k podrobnějšímu prozkoumání složení mastných kyselin, neboť detailnější analýzy umožňují zjistit o mikroorganismech ještě více. Pro tyto účely se zdá být tou nejlepší volbou plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií. Metoda slouží jak k identifikaci, tak k určení celkového zastoupení mastných kyselin v molekule fosfolipidu. Dále je využívána k určení polohy a počtu izomerií dvojných vazeb a funkčních skupin na uhlovodíkovém řetězci. Zatímco pro identifikaci a stanovení nepolárních částí fosfolipidů již existuje vhodná a osvědčená analytická ...
|
|
|
Struktura a reaktivita aniontů aromatických uhlovodíků
Obluková, Michaela ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Jašík, Juraj (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá výzkumem reaktivity aniontů aromatických uhlovodíků, vyskytujících se v ionosféře Titanu - měsíce Saturnu. K experimentu byla použita metoda tandemové hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizační technikou, kvadrupólovým hmotnostním analyzátorem a kolizní celou. Cílem bylo přispět k celkovému poznání procesů probíhajících v ionosféře Titanu. Konkrétně byla provedena experimentální studie, jak z kyseliny ftalové, isoftalové a tereftalové vytvořit příslušné isomery benzyn anion radikálů (o-, m-, p- C6H4˙- ), a bylo prozkoumáno, jakým způsobem reagují s vybranými neutrálními plyny v kolizní cele (C2H2, HC3N, CH3CN, SO2, O2).
|
|
| |
|
|
Stanovení chlorbenzoových kyselin v environmentálních vzorcích pomocí separačních technik s hmotnostní detekcí
Hostačná, Lucie ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Čabala, Radomír (oponent)
Kyseliny chlorbenzoové jsou významným kontaminantem životního prostředí, jejichž hlavním zdrojem je bakteriální degradace polychlorovaných bifenylů. Kyseliny chlorbenzoové se kumulují v životním prostředí a inhibují další bakteriální degradaci polychlorovaných bifenylů. V této práci byla optimalizována metoda pro stanovení 15 derivátů chlorbenzoových kyselin (2-CBA; 3-CBA; 4-CBA; 2,3-CBA; 2,4-CBA; 2,5- -CBA; 2,6-CBA; 3,4-CBA; 3,5-CBA; 2,3,5-CBA; 2,3,6-CBA; 2,4,6-CBA; 2,3,4,5-CBA; 2,3,5,6-CBA a 2,3,4,5,6-CBA) v půdní matrici zahrnující vysokotlakou extrakci rozpouštědlem, přečištění pomocí gelové permeační chromatografie, derivatizaci diazomethanem a následnou kvantifikaci vzorků pomocí GC/MS. Jako extrakční podmínky byly použity: extrakční směs 1% kyselina octová v hexan/acetonu (1:1 v/v), teplota 150 řC, tlak 10,34 MPa. Pro přečištění pomocí gelové permeační chromatografie bylo použito rozpouštědlo dichlormethan. Derivatizace pomocí diazomethanu měla účinnost v rozsahu 83,7 - 110,6 % s relativní směrodatnou odchylkou 2,1 - 14,2 %. Aplikace optimalizované metody na uměle kontaminované vzorky půdy při analýze pomocí GC/MS poskytla výtěžnost všech analytů v rozsahu 91,7 - - 132,5 % s relativní směrodatnou odchylkou 2,1 - 12,1 %. Validace zvolené analytické metody po aplikaci na GC/MS poskytla u...
|
|
|
Vývoj separačních metod pro stanovení perfluoralkylových karboxylových kyselin ve vzorcích životního prostředí
Dufková, Veronika ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent) ; Kubinec, Róbert (oponent)
Byla vypracována kompletní, citlivá a selektivní metoda stanovení perfluoralkylových karboxylových kyselin (PFCA, C5 - C12) ve vzorcích říčních vod metodou plynové chromatografie. Nejprve byla vyvinuta a optimalizována rychlá derivatizční reakce účinkem chlormravenčanu isobutylnatého, při které jsou jednotlivé perfluoralkylkarboxylové kyseliny převedeny na jejich těkavější isobutylestery. Dalším úkolem bylo nalezení nejvhodnější stacionární fáze pro separaci těchto analytů. Byly proměřeny retenční charakteristiky isobutylesterů PFCA na 9 běžně dostupných kapilárních kolonách s různými stacionárními fázemi. Na vybrané koloně Rtx-200MS byly sledovány fyzikálně-chemické parametry interakce analytů se stacionární fází a tyto parametry byly porovnány s nefluorovaným homologem (kyselinou oktanovou). K dispozici byl velmi citlivý plynový chromatograf s hmotnostní detekcí a negativní chemickou ionizací, který je vhodný pro vybraný druh fluorovaných látek. Důkazem jsou i naměřené instrumentální limity detekce a stanovitelnosti, které se pohybují pro isobutylestery PFCA v rozmezí 0,05 - 9,7 ng mL-1 (LOD) a 0,16 - 32,2 ng mL-1 (LOQ). Dalším krokem naší práce bylo nalezení vhodné prekoncentrační techniky pro reálné vodné vzorky. Takovou metodou se stala extrakce na tuhé fázi s využitím SPE kolonek SupelTM...
|
|
|
Stanovení sibiromycinu metodou UHPLC
Šestáková, Ivana ; Čabala, Radomír (oponent)
Za účelem stanovení sibiromycinu ve fermentačním médiu Streptosporangium sibiricum byla vyvinuta nová analytická separační metoda s využitím ultraúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC) s UV detekcí. Nově vyvinutý postup extrakce na tuhé fázi založený na kationtové výměně sloužil k prekoncentraci a přečištění fermentačního média obsahujícího sibiromycin před vlastní UHPLC analýzou. Metoda byla validována a byla prokázána linearita v koncentračním rozsahu 3,9-250,0 µg/ml s korelačním koeficientem 0,999 a výtěžností v rozmezí 71,66±3,55 % až 74,75±5,18 %. V rámci testování meze stanovitelnosti bylo dosaženo hodnoty 0,18 µg/ml s přesností vyjádřenou relativní směrodatnou odchylkou (RSD) 9,6 % a správností 97,6 %. Vyvinutá metoda pomohla ke zjištění vlivu 12 různých fermentačních médií na produkci sibiromycinu a navíc také dokázala tvorbu přírodních analogů sibiromycinu, jež byly charakterizovány pomocí hmotnostní spektrometrie.
|
|
|
Analýza derivátů pterinu kapilární zónovou elektroforézou
Krajíček, Jan ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Čabala, Radomír (oponent)
Pteriny patří do důležité skupiny látek fungující jako inhibitory, senzitizéry, enzymy, koenzymy, pigmenty atd. a spolu s karotenoidy a anthrachoninony jsou zodpovědné za charakteristické zbarvení ploštic. Tato práce byla zaměřena na vývoj kapilární elektroforetické separační metody pro analýzu šesti vybraných derivátů pterinu (biopterinu, neopterinu, isoxanthopterinu, leukopterinu, xanthopterinu a erythropterinu) a jejich následnou identifikaci ve třech formách ploštice Graphosoma semipunctatum. Separace byly realizovány v křemenné nemodifikované kapiláře termostatované na teplotu 30 řC. Separační elektrolyt se skládal z kyseliny borité, tris(hydroxymethyl)aminomethanu a disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny. V rámci optimalizační procedury byl studován vliv pH pufru, koncentrace jednotlivých složek základního elektrolytu, velikosti separačního napětí a vlnové délky UV detekce na elektromigrační chování a citlivost detekce. Za optimalizovaných separačních podmínek byly analyzovány organické extrakty ze tří forem ploštice Graphosoma semipunctatum.
|
|
| |
host ::
RSS.