Název:
Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na magnetických nosičích
Překlad názvu:
Study of reversible adsorption of nucleid acids on magnetic carriers
Autoři:
Šálek, Petr ; Ing.Daniel Horák, CSc. (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce) Typ dokumentu: Diplomové práce
Rok:
2008
Jazyk:
cze
Nakladatel: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstrakt: [cze][eng]
V diplomové práci byla studována reverzibilní absorpce nukleových kyselina na magnetických mikročásticích za různých experimentálních podmínek. Byly použity magnetické mikročástice P(HEMA-co-GMA) a magnetické sklo. Cílem bylo získat kyselinu deoxyribonukleovou (DNA) v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA, což bylo dosaženo přidáním PEG a chloridu sodného do separační směsi. Byly použity PEG různé molekulové hmotnosti a to 600, 6000 a různá výsledná koncentrace PEG v separační směsi (4, 8, 12, 16%). K ověření podmínek adsorpce DNA byly použity modelové systémy : DNA z kuřecích erytrocytů a purifikovaná DNA bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06. S rostoucí molekulovou hmotností a výslednou koncentrací PEG vzrůstalo množství eluované DNA. Získané poznatky byly využity při izolaci DNA z hrubých lyzátů buněk čisté bakteriální kultury Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06 a při izolaci DNA z reálných vzorků (tekuté mléčné výrobky, tvrdý sýr). Přítomnost cílové DNA v eluátu byla ověřena pomocí rodově (rod Lactobacillus) nebo druhově specifické (druh Bifidobacterium longum) PCR. Dále bylo při separaci DNA z reálných vzorků (tekutých mléčných výrobků) ověřeno použití dvoufázového vodného systému se současnou adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice. Byly studovány podmínky tvorby dvoufázového vodného systému, který byl vytvořen 16% PEG o různé molekulové hmotnosti (600 a 6000 g/mol) a síranem amonným o různých koncentracích. Následně bylo zjišťováno, zda použití dvoufázového systému s adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice má vliv na citlivost stanovení cílové DNA bakterií mléčného kvašení v reálných vzorcích (tj. zda byl eliminován vliv inhibitorů PCR). Předpoklad o zvýšení citlivosti PCR byl potvrzen.
Reversible adsorption of nucleid acids on magnetic carriers was studied in this diploma thesis. Magnetic P(HEMA-co-GMA) microspheres and magnetic glass particles were used. The aim of the study was to isolate DNA in suitable quality for polymerase chain reaction (PCR). Adsorption of DNA on magnetic carriers was achieved after DNA condensation by PEG and NaCl in separation mixture. PEGs of various molecular weight (600 and 6000 g/mol) and different concentrations of PEG in separation mixture (4, 8, 12, 16%) were used. Quantity of eluted DNA incerased with molecular weight and concentration of PEG in separation mixtures. Optimized experimental conditions were applied for the separation of DNA from chicken erythrocytes, purified DNA, DNA in crude lysates of bacterial cells of Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06 and from real samples (liquid dairy products, hard cheese). The presence of target DNA in eluates was tested using genus specific PCR (genus Lactobacillus) or species specific PCR (species Bifidobacterium longum) Aqueous two-phase system (liquid-liquid) was used for separation of DNA from real symplex, too. At first the condiotions aqueous two-phase systém creation were studied. It was created by 16% PEG of various molecular weight (600, 6000 g/mol) and by various concentration of ammonium sulphate. Reversible DNA adsorption on carboxyl group-containing magnetic nonporous P(HEMA-co-EDMA) microspheres for the isolation PCR-ready DNA from liquid dairy products containing PCR inhibitors was studied, too. The quality of isolated DNA was checked by PCR amplification.The presumption on the elimination of PCR inhibitors from DNA samples was confirmed.
Klíčová slova:
DNA; magnetické mikročástice; NaCl; PCR; poly(ethylenglykol); DNA; magnetic nanoparticles; NaCl; PCR; poly(ethylenglycol)
Instituce: Vysoké učení technické v Brně
(web)
Informace o dostupnosti dokumentu:
Plný text je dostupný v Digitální knihovně VUT. Původní záznam: http://hdl.handle.net/11012/12869
host ::
