|
|
Příprava rekombinantní cDNA některých lékových transportérů
Svobodová, Iveta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
SOUHRN Amplifikovali jsme CDS pro transportér ABCC4, ABCC5. Pro amplifikaci ABCC5 jsme navrhli dva systémy, pouze první systém jsme zaklonovávali. Optimální teplota annealingu byla 64 řC a optimální koncentrace hořčíku byla 2mM. Jako klonovací kit se nám osvědčil až TOPO XL. Do vektoru jsme zaklonovali CDS pro ABCC4, ABCC5. Inzerty jsme štěpili pomocí restrikčních endonukleáz. ABCC4 jsme vyštěpili Spe I a Not I. ABCC5 jsme štěpili pomocí EcoR I a Hind III. Stejnými endonukleázami jsme štěpili i pZeoSV2(-). Poté jsme inzerty zaklonovali do pZeoSV2(-).
|
|
|
Interakce MRP2 transportéru s vybranými antiepileptiky
Garajová, Katarína ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Interakce MRP2 transportéru s vybranými antiepileptiky Epilepsie je časté neurologické onemocnění postihující přibližně 1-2% populace. U většiny epileptických pacientů jsou záchvaty účinně kontrolovány v současnosti dostupnými antiepileptiky (AED - anti-epileptic drugs). Uvádí se, že přibližně 30% pacientů nedochází k zastavení záchvatů, navzdory pečlivě optimalizované léčbě. Většina těchto pacientů s farmakorezistentní epilepsií neodpovídá na léčbu různými AED s různými mechanismy účinku, což naznačuje, že rezistence u epilepsie je multifaktoriálním fenoménem nezávislým od použitého léčiva. Na základě experimentálních a klinických studií byly předloženy dvě hlavní teorie vysvětlující vznik farmakorezistence. První z nich je hypotéza cílových struktur, která se zabývá změnami ve vlastnostech cílových struktur pro AED jako příčinami jejich snížené farmakosenzitivity. Druhou je transportérová hypotéza, která hovoří o zvýšené expresi efluxních multi-drug transportérů v mozku jako příčině snížení přístupu AED k cílovým strukturám. Největší a nejvýznamnější rodinou multidrug-transportérů exprimovaných v mozku a pravděpodobně odpovědných za snížení účinné koncentrace mnohých AED v mozkové tkáni je nadrodina ABC (ATP- binding cassete) transportérů. Jedním z transportérů této rodiny, kterým byla v současnosti...
|
|
| |
|
|
Příprava rekombinantní cDNA některých lékových transportérů
Hadrabová, Zdeňka ; Červený, Lukáš (oponent) ; Štaud, František (vedoucí práce)
Pro následnou přípravu buněčné linie se zvýšenou expresí transportéru MRP3 byl připraven vhodný plazmid obsahující kódující sekvenci pro tento transportér. Experimentálně bylo stanoveno složení reakční směsi a teplotní profil PCR pro amplifikaci sekvence kódující transportér MRP3. Připojením adenosinu byl PCR produkt upraven pro klonování do plazmidu pCR® -XL-TOPO® . Plazmid pCR® -XL-TOPO® se zaklonovanou sekvencí a plazmid pZeoSV2(-) byly štěpeny restrikčními endonukleázami EcoRV a SpeI. Následně bylo možné díky komplementárním koncům vyštěpenou kódující sekvenci MRP3 zaklonovat do plazmidu pZeoSV2(-), který je vhodný pro transfekci eukaryotní buněčné linie. Klonování bylo úspěšné.
|
|
|
Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA
Šenitková, Iva ; Červený, Lukáš (oponent) ; Šimůnek, Tomáš (vedoucí práce)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Iva Šenitková Školitel: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Školitel - konzultant: RNDr. Petra Špidlová, Ph.D. Název diplomové práce: Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA Konzervovaný hypotetický lipoprotein FTT1103 je virulenčním faktorem gramnegativní intracelulární bakterie F. tularensis. Tento protein je homologní k proteinům disulfid oxidoreduktázové rodiny DsbA. Proteiny této rodiny katalyzují tvorbu disulfidických vazeb, které jsou nezbytné pro utvoření správné konformace proteinů, pro jejich aktivitu a stabilitu. Cílem práce byla identifikace vazebných partnerů lipoproteinu FTT1103 běžně nazývaného DsbA, jejichž znalost by nám mohla pomoci v hlubším pochopení role lipoproteinu DsbA ve virulenci F. tularensis. Pomocí metod molekulární biologie jsme vytvořili fúzní gen ftt1103 se sekvencí kódující FLAG® kotvu a klonovali ho do plazmidového vektoru replikujícího se ve F. tularensis. Plazmidový vektor jsme elektroporací vnesli do in frame delečního mutanta F. tularensis subsp. holarctica kmen FSC200/∆1103, čímž došlo k jeho komplementaci in trans. Protein DsbA obsahující FLAG® epitop jsme spolu s jeho...
|
|
|
Transport nesteroidních antiflogistik přes hematoencefalickou bariéru in vitro
Nováková, Iveta ; Červený, Lukáš (oponent) ; Štaud, František (vedoucí práce)
Přechod substancí mezi krevním řečištěm a centrálním nervovým systémem (CNS) je regulován hematoencefalickou bariérou (HEB). Malé, lipofilní molekuly jako jsou oxid uhličitý, kyslík nebo etanol mohou procházet přes HEB pomocí pasivní, transcelulární difuze. Naproti tomu schopnost paracelulárního přechodu hydrofilních látek je omezena intercelulárními tight junctions. Díky doprovodným transportním systémům je HEB schopna specificky regulovat transport substancí (např. živin) (Ballabh et al., 2004). Nesteroidní antiflogistika (NSAIDs) jsou v dnešní době hojně užívaná po celém světě, ale prozatím je jen málo známo o jejich schopnosti procházet přes HEB. Vyvoláváním nežádoucích účinků v CNS, mezi ně počítaje např. bolesti hlavy, závratě nebo ospalost, NSAIDs vzbudily zájem o bližší prozkoumání jejich transportních mechanizmů (pro naše studie vybrané látky: celekoxib, diklofenak, ibuprofen, lornoxikam, meloxikam, piroxikam a tenoxikam). Studie byly provedeny jak jednotlivé tak skupinové, s použitím jedné nebo více substancí současně. K pokusům byl používán in vitro model hematoencefalické bariéry vytvořený pomocí humánní buněčné linie ECV304. Protože buněčná vrstva byla pokaždé značně variabilní, byly přidávány vnitřní standardy - diazepam a carboxyfluorescein - a ve vztahu k nim byla data průchodnosti...
|
|
|
Vliv genetických faktorů na farmakokinetiku léků
Šlosárková, Petra ; Červený, Lukáš (oponent) ; Štaud, František (vedoucí práce)
Interindividuální rozdíly v aktivitě biotransformačních enzymů hrají důležitou roli ve farmakokinetice léků. Kromě zevních faktorů (věk, pohlaví, hmotnost, výživa) se zde významně uplatňují genetické dispozice. Přítomnost jednonukleotidových polymorfismů (SNPs) a mutací v genech kódujících biotransformační enzymy může vést k výrazné změně metabolismu i účinku léků. V této práci byl hodnocen vliv polymorfismu enzymu CYP2C9 na farmakokinetické parametry přípravku Nurofen forte obsahujícího racemickou směs ibuprofenu u 20 zdravých dobrovolníků (muži, česká národnost, kavkazská populace). Ve skupině bylo identifikováno celkem 17 nosičů genotypu CYP2C9*1/*1, 2 nosiči genotypu CYP2C9*1/*2 a 1 nosič genotypu CYP2C9*3/*3. Bylo zjištěno, že hodnoty farmakokine-tických parametrů u nosičů genotypu CYP2C9*1/*2 nevykazují žádné statisticky významné odchylky oproti genotypu CYP2C9*1/*1. U nosičů genotypu CYP2C9*3/*3 byla hodnota AUC(0-inf) vyšší o 113%, hodnota t1/2 o 90% a hodnota clearance o 54% nižší oproti průměrným hodnotám nosičů genotypu CYP2C9*1/*1. V důsledku významných změn ve farmakokinetických parametrech mohou být nosiči genotypu CYP2C9*3/*3 vystaveni při dlouhodobém užívání nesteroidních protizánětlivých látek vyššímu riziku rozvoje nežádoucích účinků léčby (ulcerace a gastroduodenální krvácení)....
|
|
|
Inhibice histon-deacatyláz a mitochondriální pohyb v neuronech
Prokopová, Iva ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
Inhibice histon deacetyláz a mitochondriální pohyb v neuronech Mitochondriální pohyb je nezbytný pro správnou funkci neuronů a jeho narušení vede k neurodegeneraci. Podařilo se nám nalézt signifikantní rozdíly v pohybu mitochondrií mezi neurony striata a cortexu, získanými z mozku potkanů. Ve striatu se mitochondrie pohybují nižšími průměrnými rychlostmi a se sníženou celkovou dynamikou v porovnání s cortexem, přičemž zaujímají stejnou frakční okupaci nervových výběžků. V diplomové práci je diskutováno, jak tento fakt může přispět ke zvýšené náchylnosti k neurodegeneraci buněk striata. Použili jsme dvě různé metody analýzy mitochondriálního pohybu: manuální a polo- automatickou. Tyto metody dokáží určit průměrné rychlosti jednotlivých mitochondrií stejně jako celkovou dynamiku mitochondrií v určité sledované oblasti. Analyzovali jsme pouze neurony s vytvořenými synaptickými propojeními, mitochondrie se pohybovaly v obou směrech stejnými průměrnými rychlostmi, proto nebyly dále rozlišovány dle směru pohybu. Naše předběžné výsledky také odhalily, že inhibice histon deacetyláz pomocí trichostatinu A zvyšuje pohyb mitochondrií v neuronech striata, nezávisle na mitochondriální frakční okupaci a hladině Ca2+ ve výběžcích neuronů. Předpokládáme, že pravděpodobným mechanismem vzrůstu dynamiky mitochondrií...
|
|
|
Modifikace metody real-time PCR a její využití k detekci mikroorganismů rodu Bacillus
Hubálková, Lenka ; Kroča, Michal (vedoucí práce) ; Červený, Lukáš (oponent)
The real-time polymerase chain reaction (PCR) is one of the most widely used techniques in modern molecular biology. This method is based on fluorescent monitoring of DNA amplification by using some detection system specific for reaction product. Since its development in the 1990s many different detection formats have been developed. These include dsDNA specific dyes, which are very simple and cheap, but not sufficiently specific, and various types of sequence- specific fluorescent oligonucleotide probes or modified primers, which provide a high-level of specifity, but are relatively expensive and require careful optimization of reaction conditions. An alternative approach to monitoring of real-time PCR reactions is presented in this study. Its function is based on the observation that guanine nucleotide can quench fluorescence of some fluorescent labels. The approach makes use of an oligonucleotide primer containing a labelled cytosine nucleotide at its 5' end. When such a primer is incorporated into the product of amplification, its fluorescence is quenched by the quanine nucleotide complementary to the modified cytidine. This system of "5' labelled primers" is easy and low-cost like the dsDNA specific dyes, but it is more specific, because non-specific products of amplification are not detected....
|
|
|
Studování příčin rezistence a identifikace bakteriálních izolátů pomocí širokého spektra laboratorních metod
Bavlovič, Jan ; Červený, Lukáš (vedoucí práce) ; Mladěnka, Přemysl (oponent)
Karlova Univerzita v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Student: Jan Bavlovič Školitelé: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Prof. Doutora Luísa Peixe Konzultanti: Doutora Ângela Novais Doutora Ana Freitas Název diplomové práce: Charakterizace multirezistentních izolátů Klebsiella pneumoniae a Enterococcus faecium spektroskopickými a genotypickými metodami Stále se zvyšující antimikrobiální rezistence je v současné době celosvětovým problémem. Mezi významné metody charakterizace antimikrobiální rezistence patří tradičně genomické postupy. Cílem této studie bylo zhodnotit potenciál metody Fourier transform infrared spectroscopy se zeslabeným kompletním odrazem (FTIR-ATR) pro identifikaci multirezistentních karbapenemasu produkujících K. pneumoniae a E. faecium izolátů. Analyzovali jsme 20 klinických K. pneumoniae izolátů získaných z různých laboratoří v Portugalsku v období od března 2014 do září 2015 a 143 dříve popsané vankomycin-rezistentní E. faecium izoláty získaných od lidí, zvířat a životního prostředí v 26 zemích mezi lety 1992 a 2015. Izoláty byly primárně charakterizovány genotypovými metodami, včetně testování antimikrobiální citlivosti, detekce karbapenemáz a betalaktamáz s rozšířeným spektrem (ESBLs), identifikace odolnosti vůči antibiotikům...
|
host ::
RSS.