|
|
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (referee) ; Krčma, František (referee) ; Obruča, Stanislav (advisor)
Techniky analýzy jednotlivých buněk neboli single-cell analýzy, jsou velmi důležité v kontextu studia důležitých biotechnologických mikroorganismů. V biotechnologických procesech je optimální mít rychlé, efektivní a real-time analýzy, které lze provést s minimální přípravou vzorku. Proto jsme v rámci předložené disertační práce využili autofluorescenci jako marker fyziologického stavu mikrobiální kultury, který je možné analyzovat pomocí fluorescenční mikroskopie a/nebo průtokové cytometrie. Nejdříve bylo potvrzeno, na základně emisních spekter, že zelená autofluorescence emitovaná bakteriemi Cupriavidus necator H16 a jejím polyhydroxyalkanoáty (PHA) neprodukujícím mutantem Cupriavidus necator PHB-4, pochází skutečně z flavinů. Emisní maximum bylo naměřeno v rozmezí 510–550 nm pro FAD, FMN a riboflavin – bohužel jednotlivá spektra od sebe nebylo možné rozeznat, a 515 nm pro oba bakteriální kmeny Cupriavidus necator. Byly nalezeny dvě maxima excitačních spekter, jedno v rozmezí 360–370 nm a druhé okolo 440 nm. Z těchto poznatků byl sestaven nový protokol pro fluorescenční mikroskopii – laser byl nastaven na hodnotu 467 nm a emisní filtr pro detekci byl vybrán 520/35 nm. Flaviny a jejich autofluorescence může být take použita v kombinaci s jinými fluorofory, když jsou použity multiparametrické analýzy, ale je důrazně doporučeno, aby vybrané fluorescenční sondy buď emitovaly v jiném rozmezí, než je 500–550 nm anebo byla jejich doba života excitovaného stavu jiná, než je interval 3,2–3,7 a 4,2 – 4,9 ns. Tyto doby života navíc zůstaly konstantní, i když byly buňky vystaveny kultivačním a stresovým podmínkám. To z nich dělá velmi stabilní marker v porovnání s dynamickým charakterem intenzit fluorescence. Dále byl optimalizován protokol pro značení bakterie C. necator s využitím PHA specifické sondy BODIPY 493/503. Optimální koncentrace této lipofilní sondy byla stanovena na 2,5 µg ml-1 a sondu je možné dle našich dat aplikovat společně s viabilitní sondou propidium iodidem. Tento protokol byl také využit pro studium morfologie PHA-syntetizující halofilní bakterie Halomonas halophila. Pro stanovení UV-protektivních vlastností PHA obsaženého v bakterii Cupriavidus necator, byl optimalizován další protokol, tentokrát pro ROS citlivou sondu CM-H2DCFDA, která byla stanovená jako citlivější v porovnání s její nemethylovanou formou. V této studii byly navíc potvrzeny UV-protektivní vlastnosti PHA na bakterii Cupriavidus necator H16 v porovnání s PHA nesyntetizujícím kmenem Cupriavidus necator PHB-4.
|
guest ::
