|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
|
|
Expression, characterisation and biological role of Ddi II, putative protein partner of proteasomal complex
Sivá, Monika ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Homeostáze vnitřního prostředí buňky je vysoce regulována souborem procesů, mezi které patří i degradace nežádoucích proteinů v buňce pomocí proteasom-ubikvitinového systému. Tento systém se skládá z řady navazujících dějů. Nejdřív je substrát díky specifickým enzymům posttranslačně označen ubikvitinem, následně je transportován a degradován v proteasomu. Rozpoznání substrátu proteasomem může být buď přímé díky proteasomálním receptorům nebo nepřímé pomocí tzv. přenosových proteinů. Tyto přenašeče vážou ubikvitinem označený substrát, který transportují k 19S podjednotce proteasomu. Po navázání se k 19 S proteasomu uvolní substrát do proteasomální kavity, kde je následně degradován. Funkce přenosových proteinů je podmíněna dvoudoménovým uspořádaním. Na N- terminálním konci je tzv. UBL doména "ubiquitin-like domain", která interaguje s proteasomem, a C-terminální konec se vyznačuje alespoň jedním ze skupiny motivů interagujících s ubikvitinem, který váže polyubikvitinový řetězec substrátu. Tato práce se zaměřuje na "DNA damage-inducible protein homolog 2" (Ddi2), protein, který pravděpodobně patří do této skupiny "přenašečů" v lidském organizmu, a na jeho případnou interakci s protesomální podjednotkou PSMD2. UBL doména lidského Ddi2 a protein PSMD2 byly rekombinantně připraveny v bakteriálním expresním...
|
|
|
Deciphering the biological role of Ddi1-like protein family
Sivá, Monika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Stopka, Pavel (oponent)
Představitelé rodiny proteinů podobných Ddi1 (z angl. DNA damage-inducible protein homolog 1) patří do skupiny tzv. "přenašečů", které jsou v buňce zodpovědné za regulaci degradace proteinů v ubikvitin-proteasomálním systému. Proteiny podobné Ddi1 se od ostatních přenašečů liší specifickou doménou podobnou retrovirálním proteasam, která patří mezi aspartové proteasy. Nedávno byla v jejich struktuře taktéž objevena vysoce konservovaná helikální doména. V poslední době se objevují studie, které popisují nové funkce členů rodiny protein podobných Ddi1 a to v rámci udržování buněčné homeostázy v odpovědi na stresové podněty, např. v reakci na proteotoxické podmínky nebo v opravě poškozené DNA. Tato disertační práce se zabývá charakterizací vybraných členů rodiny proteinů podobných Ddi1 a to jak na molekulární úrovni, tak v biologických studiích na myších modelech. Byla vyřešena struktura domény podobné ubikvitinu (ubiquitin-like domain, UBL) v rámci kvasinkového proteinu Ddi1. Následně byly porovnány vazebné vlastnosti domén UBL kvasinkového proteinu Ddi1 a lidského proteinu DDI2. Doména UBL a motiv vázající ubikvitin (ubiquitin interacting motif, UIM) lidského homologu DDI2 sice specificky vážou ubikvitin, zároveň je však tato vazba velice slabáv porovnání s jinými ubikvitin vazebnými doménami. Naše...
|
|
|
Role ubikvitin ligázy Fbxo38 v myší spermatogenezi
Zobalová, Eliška ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Stopka, Pavel (oponent)
Ubikvitin ligázy závislé na cullinových podjednotkách jsou zodpovědné za regulaci většiny buněčných procesů. Navzdory tomu, že jejich mutované formy jsou příčinou vzniku mnoha lidských onemocnění, nejsou jejich fyziologické role dostatečně popsány. V rámci předkládaných výsledků jsme se soustředili na fyziologickou roli ubikvitin ligázy SCFFBXO38 (SKP1-CULLIN1-FBXO38), jejíž mutované formy jsou zodpovědné za progresi distální neuropatie. Příprava myšího modelu absence FBXO38 odhalila vyšší mortalitu homozygotních mláďat a růstový defekt, a to jak na úrovni celého organismu, tak i jednotlivých orgánů, zejména jater a varlat. Samci s delecí v genu Fbxo38 měli výrazně nižší reprodukční schopnost, což souviselo s nižší produkcí maturovaných spermií a patologickými změnami ve struktuře semenotvorných tubulů. Zjistili jsme, že protein FBXO38 je funkčně exprimován v Sertoliho buňkách zodpovědných za regulaci spermatogeneze a integrity semenotvorných kanálků. Bližší analýza spermatogenních populací odhalila defekt na úrovni spermatocytární diferenciace. Dynamika této diferenciace je závislá na funkční integritě hematotestikulární bariéry tvořené mezibuněčnými spoji Sertoliho buněk. Potvrdili jsme, že retenční schopnost této bariéry byla u mutovaných zvířat snížena, což korelovalo s poklesem exprese její...
|
|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
|
|
Deciphering the biological role of Ddi1-like protein family
Sivá, Monika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Stopka, Pavel (oponent)
Představitelé rodiny proteinů podobných Ddi1 (z angl. DNA damage-inducible protein homolog 1) patří do skupiny tzv. "přenašečů", které jsou v buňce zodpovědné za regulaci degradace proteinů v ubikvitin-proteasomálním systému. Proteiny podobné Ddi1 se od ostatních přenašečů liší specifickou doménou podobnou retrovirálním proteasam, která patří mezi aspartové proteasy. Nedávno byla v jejich struktuře taktéž objevena vysoce konservovaná helikální doména. V poslední době se objevují studie, které popisují nové funkce členů rodiny protein podobných Ddi1 a to v rámci udržování buněčné homeostázy v odpovědi na stresové podněty, např. v reakci na proteotoxické podmínky nebo v opravě poškozené DNA. Tato disertační práce se zabývá charakterizací vybraných členů rodiny proteinů podobných Ddi1 a to jak na molekulární úrovni, tak v biologických studiích na myších modelech. Byla vyřešena struktura domény podobné ubikvitinu (ubiquitin-like domain, UBL) v rámci kvasinkového proteinu Ddi1. Následně byly porovnány vazebné vlastnosti domén UBL kvasinkového proteinu Ddi1 a lidského proteinu DDI2. Doména UBL a motiv vázající ubikvitin (ubiquitin interacting motif, UIM) lidského homologu DDI2 sice specificky vážou ubikvitin, zároveň je však tato vazba velice slabáv porovnání s jinými ubikvitin vazebnými doménami. Naše...
|
|
|
Expression, characterisation and biological role of Ddi II, putative protein partner of proteasomal complex
Sivá, Monika ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Homeostáze vnitřního prostředí buňky je vysoce regulována souborem procesů, mezi které patří i degradace nežádoucích proteinů v buňce pomocí proteasom-ubikvitinového systému. Tento systém se skládá z řady navazujících dějů. Nejdřív je substrát díky specifickým enzymům posttranslačně označen ubikvitinem, následně je transportován a degradován v proteasomu. Rozpoznání substrátu proteasomem může být buď přímé díky proteasomálním receptorům nebo nepřímé pomocí tzv. přenosových proteinů. Tyto přenašeče vážou ubikvitinem označený substrát, který transportují k 19S podjednotce proteasomu. Po navázání se k 19 S proteasomu uvolní substrát do proteasomální kavity, kde je následně degradován. Funkce přenosových proteinů je podmíněna dvoudoménovým uspořádaním. Na N- terminálním konci je tzv. UBL doména "ubiquitin-like domain", která interaguje s proteasomem, a C-terminální konec se vyznačuje alespoň jedním ze skupiny motivů interagujících s ubikvitinem, který váže polyubikvitinový řetězec substrátu. Tato práce se zaměřuje na "DNA damage-inducible protein homolog 2" (Ddi2), protein, který pravděpodobně patří do této skupiny "přenašečů" v lidském organizmu, a na jeho případnou interakci s protesomální podjednotkou PSMD2. UBL doména lidského Ddi2 a protein PSMD2 byly rekombinantně připraveny v bakteriálním expresním...
|
|
|
The ubiquitin–proteasome system is involved in the regulation of activity of spermadhesin aqn1 and acrosin inhibitor, the two sperm surface proteins, during porcine fertilization
Jonáková, Věra ; Yi, Y.J. ; Postlerová, Pavla ; Pěknicová, Jana
The spermadhesin AQN1and acrosin inhibitor (AI/SPINK2) proteins bind to the sperm plasma membrane at ejaculation. The AQN1 has been implicated in sperm binding to zona pellucida (ZP) of the oocyte as well as in sperm interactions with the epithelium of the oviductal sperm reservoir. The SPINK2 protects spermatozoa from proteolytic degradation during their trip up the female genital tract toward the oocyte. This study examined the role of two components of the 19S proteasome regulatory complex, the ubiquitin C-terminal hydrolase UCHL3 and PSMD8 in the AQN1-mediated boar sperm binding to zona pellucida. Interaction of PSMD4 subunit with the acrosomal surface-associated acrosin inhibitor AI/SPINK2 provided another line of evidence for the presence of 26S proteasomes on the sperm surface. Detection of the ubiquitinated forms of SPINK2 supports the hypothesis that SPINK2 activity is controlled by ubiquitin-proteasome system (UPS). The activity of the porcine AQN1, and thus the efficiency of sperm-oocyte recognition/binding, may be controlled by elements of the sperm surface-bound UPS, in particular by UCHL3, and by proteasomal regulatory complex subunit PSMD8. Ubiquitinated isoforms of AQN1 were also detected in boar sperm extracts. The UCHL inhibitor ubiquitin aldehyde and the antibodies against UCHL3 or PSMD8 increased the rate of sperm-ZP penetration and polyspermy during porcine in vitro fertilization (IVF). In contrast, the addition of recombinant UCHL3 to fertilization medium significantly reduced polyspermy rates, while maintaining satisfactory rate of monospermic fertilization (~50%). These results are significant for production agriculture. The high level of polyspermy that hinders porcine IVF for commercial embryo transfer could be mitigated by the modulation of the UCHL3 and/or PSMD8 activity.
|
host ::
RSS.