|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Charakteristika stresových granulí u kvasinky Saccharomyces cerevisiae
Slabá, Renata ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
8 ABSTRAKT Ke své správné funkci musí proteiny mít nativní konformaci. Pokud dojde k narušení konformace vlivem vnějších podmínek nebo genetické mutace, proteiny se stávají náchylnější k agregaci. Existují různé typy proteinových agregátů. Mohou se vytvářet různě stabilní bezmembránové inkluze, které slouží k odklizení poškozených proteinů z míst, kde by mohly interferovat s důležitými buněčnými procesy. Jiné typy agregátů mohou sloužit k přechodnému uskladnění proteinů a tím je chránit před poškozením v důsledku stresu. Jedním z těchto přechodných typů agregátů jsou stresové granule (SG), jejichž tvorbu indukuje např. tepelný stres. SG obsahují mRNA, složky translačního aparátu a řadu dalších proteinů. Jedním z nich je protein Mmi1, malý vysoce konzervovaný protein s neznámou funkcí. Jeho asociace se stresovými granulemi a částečná kolokalizace s chaperonem Cdc48 a proteasomem indikuje, že by mohl zprostředkovávat degradaci proteinů poškozených tepelným stresem. Zjistili jsme, že kvasinkový prionový protein Sup35 je také složkou stresových granulí. Vzhledem k jeho schopnostem agregace proto existoval předpoklad, že jeho prionová doména by mohla sloužit jako lešení pro sestavování SG. Nicméně ukázali jsme, že delece prionové domény tohoto proteinu dynamiku tvorby stresových granulí neovlivňuje. Kvasinka...
|
|
|
Lidské proteiny z rodiny 4E ve stresových granulích a jejich další charakterizace
Hrbková, Pavlína ; Frydrýšková, Klára (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent)
Eukaryotický iniciační faktor 4E (eIF4E), je klíčovou součástí v zahájení a regulaci translace v lidských buňkách. Byli charakterizováni tři členové lidských eIF4E proteinů: eIF4E1, eIF4E2 a eIF4E3. Důsledkem působení stresu na buňku je inhibice iniciace translace a rozpad polyzomů, což je provázeno tvorbou cytoplazmatických RNA granulí, zvaných stresové granule (SG). Stresové granule jsou dynamické struktury, jejichž složení se může lišit v závislosti na typu buňky a stresovém podnětu. Pomocí fluorescenční mikroskopie byly vizualizovány dvojice lidských translačních iniciačních faktorů z rodiny proteinů 4E za působení vysoké teploty (TS), arzenitanu sodného (AS) a hypoxie, a byla pozorována jejich lokalizace do SG. Kolokalizace proteinů z rodiny 4E byla detekována pomocí stabilních buněčných linií, obsahující jeden 4E protein ve fúzi s GFP, zatímco druhý 4E protein byl detekován protilátkou. Tato práce potvrdila tezi, že eIF4E1 je součástí veškerých SG, jak za TS, tak za AS. Dále ukázala, že proteiny eIF4E1 a eIF4E3 tvoří společně více SG než proteiny eIF4E1, respektive eIF4E3, s eIF4E2. Důležitým zjištěním také je, že přítomnost toho kterého 4E proteinu nemá na složení SG žádný vliv. V této práci byly též vizualizovány vybrané proteiny různých skupin v SG za TS a AS. Ukázalo se, že složení SG za...
|
|
|
Tvorba proteinových granulí v diferencovaných buňkách kvasinkových kolonií
Kočířová, Eliška ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou jednobuněčné eukaryotické organismy schopné tvorby mnohobuněčných útvarů - kolonií a biofilmů. V průběhu vývoje kolonií laboratorních kmenů dochází k diferenciaci buněk na specificky lokalizované buněčné subpopulace - U a L buňky, lokalizované v horní, resp. dolní části kolonie. U a L subpopulace buněk mají odlišnou morfologii, liší se výrazně svými metabolickými procesy a odolností vůči stresu. Proteinové granule jsou nemembránové "organely" popsané u jednobuněčných i mnohobuněčných eukaryotických organismů. Tvorba proteinových granulí souvisí s fyziologickým stavem buňky (např. s chronologickým i replikativním stárnutím), ale i s podmínkami vnějšího prostředí, jejich změnou a reakcí buněk na působení stresových faktorů. Poměrně značná frakce proteinů se během života buňky objeví v některém typu proteinových granulí. Tvorba granulí může zvyšovat fitness buněk, pomáhá jim vyrovnat se s limitujícími zdroji energie a je stěžejní při adaptaci buněk na stres. Řada proteinů mění svoji lokalizaci v buňce v závislosti na její fyziologii a konkrétní lokalizace takových proteinů proto může být jakýmsi "markerem" specifického fyziologického stavu. V každém typu granulí se vyskytují proteiny, které lze považovat za specifické "proteinové markery" daného...
|
|
|
Role stresových granulí a 4E-BP v teplem stresovaných buňkách S. cerevisiae
Kolářová, Věra ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Zimmermannová, Olga (oponent)
Buňky dokáží reagovat velmi rychle a specificky na stresové podmínky. Jedním z hla- vních regulačních procesů je ovlivnění translace, specificky iniciace translace, zapojením inhibičních faktorů. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou známy dva eIF4E va- zebné proteiny (4E-BP), proteiny Eap1 a Caf20, které jsou uváděny jako represory iniciace translace závislé na čepičce na 5' konci mRNA. Mikroskopická fluorescenční analýza in vivo ukázala rozdílnou reakci proteinu Caf20 a Eap1 na tepelný stres (46◦ C, 10 minut). Protein Caf20 neodpovídá na tepelný stres a zůstává difuzní v cytoplazmě, na rozdíl od Eap1, který akumuluje do shluků v blízkosti stresových granulí (SG). Tato práce ukazuje také na zapojení proteinu Eap1 v tvorbě SG, kdy delece genu EAP1 vede k formování drobnějších neostrých granulí. V souladu s pozorováním fluo- rescenčně značeného proteinu Caf20 v reakci na tepelný stres, neovlivňuje delece genu CAF20 tvorbu teplem indukovaných stresových granulí u kvasinky. Pomocí polysomální analýzy bylo ukázáno, že nepřítomnost represoru iniciace trans- lace neovlivňuje globální represi translace v reakci na tepelný stres a translace je umlčena i v nepřítomnosti represoru iniciace translace. Delece EAP1 možná...
|
|
|
Využití fluorescenční mikroskopie pro bližší popis dynamiky proteinů ALBA u Arabidopsis thaliana
Popelářová, Anna ; Honys, David (vedoucí práce) ; Vosolsobě, Stanislav (oponent)
Proteiny ALBA byly objeveny u Archaea před více než 30 lety. Postupně bylo zjištěno, že se vyskytují i u eukaryot a jejich struktura je velmi konzervovaná. V obou zmíněných doménách organizmů byla pozorována funkční forma těchto proteinů v dimerech schopných vazby DNA i RNA. Jejich role se však během evoluce rozrůznily a mezi jednotlivými organizmy se liší. U Archaea se ALBA podílí na organizaci genomu a také na interakcích s RNA. U eukaryot existují dvě podrodiny proteinů ALBA nazvané Rpp20 a Rpp25. Některé organizmy mají jen jeden protein ALBA z každé podrodiny, ale například u rostlin byly geny ALBA zmnoženy. Tyto proteiny spolu mohou interagovat a podílet se na ontogenetickém vývoji a reakcích na stres. Dle některých studií by se u Arabidopsis thaliana mohly proteiny ALBA nacházet v jádře a podílet se na udržování stability DNA nebo sestřihu transkriptů pre-rRNA. Podle jiných studií jsou lokalizovány v cytoplazmě a mají úlohu v metabolizmu a reakci na stres. V genomu A. thalina bylo identifikováno šest různých genů ALBA, tři z každé podrodiny. V této práci byly zkoumány proteinové interakce mezi všemi těmito proteiny metodou bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) a bylo zjištěno, že spolu interagují především proteiny mezi podrodinami. Dále byla pozorována lokalizace těchto proteinů v...
|
|
|
Tvorba proteinových granulí v diferencovaných buňkách kvasinkových kolonií
Kočířová, Eliška ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou jednobuněčné eukaryotické organismy schopné tvorby mnohobuněčných útvarů - kolonií a biofilmů. V průběhu vývoje kolonií laboratorních kmenů dochází k diferenciaci buněk na specificky lokalizované buněčné subpopulace - U a L buňky, lokalizované v horní, resp. dolní části kolonie. U a L subpopulace buněk mají odlišnou morfologii, liší se výrazně svými metabolickými procesy a odolností vůči stresu. Proteinové granule jsou nemembránové "organely" popsané u jednobuněčných i mnohobuněčných eukaryotických organismů. Tvorba proteinových granulí souvisí s fyziologickým stavem buňky (např. s chronologickým i replikativním stárnutím), ale i s podmínkami vnějšího prostředí, jejich změnou a reakcí buněk na působení stresových faktorů. Poměrně značná frakce proteinů se během života buňky objeví v některém typu proteinových granulí. Tvorba granulí může zvyšovat fitness buněk, pomáhá jim vyrovnat se s limitujícími zdroji energie a je stěžejní při adaptaci buněk na stres. Řada proteinů mění svoji lokalizaci v buňce v závislosti na její fyziologii a konkrétní lokalizace takových proteinů proto může být jakýmsi "markerem" specifického fyziologického stavu. V každém typu granulí se vyskytují proteiny, které lze považovat za specifické "proteinové markery" daného...
|
|
|
Role proteinu RACK1 v regulaci translace za stresových podmínek
Chvalová, Věra ; Groušl, Tomáš (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
RACK1 (Receptor pro aktivovanou proteinkinázu C 1) je evolučně konzervovaný protein s esenciální rolí ve všech studovaných eukaryotických organismech, kromě kvasinek. RACK1 byl původně popsán jako vazebný partner proteinkinázy C, ale dnes už je známá jeho významná role v dalších buněčných signalizacích, jako např. MAPK, Src nebo FAK. Díky tomu se RACK1 podílí na regulaci klíčových buněčných procesů včetně migrace, apoptózy či translace. Jako vazebný partner malé ribozomální podjednotky přispívá RACK1 k regulaci translace zprostředkováním přenosu signálů mezi buněčnými drahami a některými kompo- nenty translace, např. mezi PKC a eIF6. RACK1 má také funkci v translaci za stresových podmínek. Během stresu dochází k poklesu celkové úrovně translace, k syntéze specifických mRNA významných pro buněčnou odpověď na stres a zároveň k formování cytosolických útvarů zvaných stresové granule (SG). Stresové granule slouží k ochraně mRNA a translač- ních komponent před degradací a zároveň brání vstupu buňky do apoptózy. RACK1 byl identifikován jako jedna z mnoha komponent přítomných v SG. Lokalizace RACK1 do SG má za následek inhibici pro-apoptotických signálních drah regulovaných tímto proteinem. Cílem této diplomové práce bylo přispět k bližšímu objasnění role RACK1 v translaci obecně i za stresových podmínek....
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Lidské proteiny z rodiny 4E ve stresových granulích a jejich další charakterizace
Hrbková, Pavlína ; Frydrýšková, Klára (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent)
Eukaryotický iniciační faktor 4E (eIF4E), je klíčovou součástí v zahájení a regulaci translace v lidských buňkách. Byli charakterizováni tři členové lidských eIF4E proteinů: eIF4E1, eIF4E2 a eIF4E3. Důsledkem působení stresu na buňku je inhibice iniciace translace a rozpad polyzomů, což je provázeno tvorbou cytoplazmatických RNA granulí, zvaných stresové granule (SG). Stresové granule jsou dynamické struktury, jejichž složení se může lišit v závislosti na typu buňky a stresovém podnětu. Pomocí fluorescenční mikroskopie byly vizualizovány dvojice lidských translačních iniciačních faktorů z rodiny proteinů 4E za působení vysoké teploty (TS), arzenitanu sodného (AS) a hypoxie, a byla pozorována jejich lokalizace do SG. Kolokalizace proteinů z rodiny 4E byla detekována pomocí stabilních buněčných linií, obsahující jeden 4E protein ve fúzi s GFP, zatímco druhý 4E protein byl detekován protilátkou. Tato práce potvrdila tezi, že eIF4E1 je součástí veškerých SG, jak za TS, tak za AS. Dále ukázala, že proteiny eIF4E1 a eIF4E3 tvoří společně více SG než proteiny eIF4E1, respektive eIF4E3, s eIF4E2. Důležitým zjištěním také je, že přítomnost toho kterého 4E proteinu nemá na složení SG žádný vliv. V této práci byly též vizualizovány vybrané proteiny různých skupin v SG za TS a AS. Ukázalo se, že složení SG za...
|
host ::
RSS.