|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Functional analysis of hPrp8 mutations linked to retinitis pigmentosa.
Matějů, Daniel ; Cvačková, Zuzana (vedoucí práce) ; Král, Vlastimil (oponent)
hPrp8 je esenciální faktor účastnící se sestřihu pre-mRNA. Tento vysoce konzervovaný protein je součástí U5 malé jaderné ribonukleoproteinové částice (U5 snRNP), která představuje jednu ze základních komponent spliceozomu. hPrp8 působí jako klíčový regulátor aktivace spliceozomu a interaguje přímo s U5 snRNA a s oblastmi pre-mRNA, které se účastní transesterifikačních reakcí během sestřihu. Mutace v hPrp8 způsobují autozomálně dominantní formu retinitis pigmentosa (RP), dědičného onemocnění, které vede k postupné degeneraci sítnice. V této práci jsme zkoumali, jak mutace spojené s RP ovlivňují funkci proteinu hPrp8. Použili jsme metodu 'BAC recombineering' k vytvoření mutovaných variant hPrp8-GFP a připravili jsme stabilní buněčné linie exprimující tyto rekombinantní proteiny. Mutované proteiny byly exprimovány a lokalizovány do jádra, avšak jedna z bodových mutací výrazně ovlivnila lokalizaci a stabilitu hPrp8. Další experimenty napověděly, že mutace spojené s RP ovlivňují schopnost hPrp8 interagovat s dalšími komponenty U5 snRNP a s pre-mRNA. Dále jsme studovali biogenezi U5 snRNP komplexů. Pomocí siRNA jsme odstranili hPrp8 a narušili tak formování U5 snRNP komplexu. Zjistili jsme, že nekompletní U5 snRNP komplexy se hromadí v Cajalových tělískách, což značí, že tyto jaderné struktury hrají roli...
|
|
|
The role of pre-mRNA splicing in human hereditary diseases
Malinová, Anna ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Malá jaderná ribonukleoproteinová částice U5 (U5 snRNP) je jednou z hlavních komponent spliceozomu, komplexu který katalyzuje sestřih pre-mRNA. U5 snRNP je tvořena molekulou RNA a několika proteiny, nicméně o tom jak jsou jednotlivé díly postupně skládány v maturovanou částici, se mnoho neví. Ukázali jsme, že po depleci proteinu PRPF8, jedné z klíčových složek U5 snRNP, se částice správně neskládají a akumulují se v jaderných strukturách zvaných Cajalova tělíska. K objasnění role PRPF8 v biogenezi U5 snRNP jsme se dále rozhodli využít mutace tohoto proteinu, které byly identifikovány u pacientů s degenerativním onemocněním oční sítnice, retinitis pigmentosa (RP). Vytvořili jsme stabilní buněčné linie exprimující mutantní varianty proteinu PRPF8 a ukázali jsme, že RP mutace narušují skládání U5 snRNP, což následně vede ke snížení efektivity sestřihu pre-mRNA v buňkách. Mutantní PRPF8 se spolu s proteinem EFTUD2 hromadí v cytoplazmě a vytvoření tohoto komplexu je zdá se prvním krokem skládání U5 snRNP. Dále jsme s využitím proteomických metod identifikovali řadu nových faktorů včetně komlexu HSP90/R2TP a proteinu ZNHIT2, které se váží na U5 snRNP. Naše výsledky ukazují, že tyto faktory preferenčně interagují...
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
|
|
Molecular mechanism of quality control during snRNP biogenesis
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Sestřihový komplex patří mezi největší a nejdynamičtější molekulární mašinérie v buňce. Hlavní část komplexu je tvořena pěti malými jadernými ribonukleoproteinovými částicemi (zkráceně snRNP). Ty vznikají složitým procesem, který je rozdělen do několika kroků. SnRNP částice jsou navíc během sestřihu výrazně přestavěny a po každé sestřihové reakci proto musí dojít k jejich regeneraci. Jak skládání nových snRNP, tak recyklaci post-sestřihových částic řídí a usnadňují specializované chaperony. V této práci jsem se zaměřila na dva chaperony snRNP částic, SART3 a TSSC4, a odhalila molekulární detaily jejich funkce. Zatímco TSSC4 nebyl dříve charakterizován, SART3 byl popsán jako faktor specifický pro U6 snRNP, který napomáhá sloučení U6 a U4 částic do di-snRNP komplexu a je důležitý pro recyklaci použitých U4/U6 snRNP. Mechanismus, kterým funguje, byl však nejasný. V této práci přináším důkaz, že SART3 interaguje s post-sestřihovým komplexem a navrhuji, že by se SART3 mohl podílet na jeho rozpadu. Naše data dále naznačují, že se SART3 váže na U6 snRNP už v rámci post-sestřihového komplexu a koordinuje tak celou recyklační fázi U6 částice. Dále zde ukazuji, že TSSC4 je nový chaperon specifický pro U5 snRNP a že napomáhá U5 a U4/U6 částicím, aby se složily do finálního tri-snRNP komplexu. Identifikovali...
|
|
|
Vliv transkripčních regulačních elementů na sestřih pre-mRNA
Volek, Martin ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
Při sestřihu pre-mRNA jsou z pre-mRNA odstraněny introny a dochází ke spojení exonů. Současné studie dokazují, že až 95 % genů, které mají více než dva exony, se mohou účastnit alternativního sestřihu pre-mRNA, tedy procesu, při kterém může či nemusí dojít k zahrnutí exonu do výsledné mRNA. Většina sestřihu pre-mRNA se uskutečňuje kotranskripčně, tedy v době, kdy je RNA polymerása II stále spojena s pre-mRNA. Alternativní sestřih je velmi komplikovaný a komplexní proces, který probíhá v blízkosti DNA a histonů, jež mohou tento proces ovlivňovat. Předchozí studie validovaly gen fibronektinu (FN1) a jeho alternativní exony EDA a EDB (extra doména A a B) jako vhodné modely pro studium alternativního sestřihu. Studie používající minireportérový systém FN1 skládající se z exonu EDA, dvou sousedních intronů a exonů dokázaly, že při vnesení transkripčního enhanceru SV40 před promotor tohoto systému, dochází ke snížení zahrnutí exonu EDA ve výsledné mRNA. Není však známe, zda obdobný mechanizmus funguje i mimo reportérový systém v genomu a zda vzdálené transkripční regulační elementy mohou mít vliv na alternativní sestřih. Proto byl pomocí programů The Ensemble Regulatory Build a FANTOM 5 identifikován potenciální transkripční enhancer, který se nachází 23,5 kbp před místem začátku transkripce (TSS) pro...
|
|
|
Ribosomal protein Rpl22 regulates the splicing of its own transcripts
Nemčko, Filip ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Müller-McNicoll, Michaela (oponent)
Kvasinka Saccharomyces cerevisiae patrí medzi organizmy s malým počtom intrónov, ktoré sa nachádzajú v približne 5% jej génov. Najdôležitejšou skupinou takýchto génov sú gény kódujúce ribozomálne proteíny. Tie sú okrem iného vysoko exprimované a častokrát kódované dvoma paralógmi. Parenteau s kolegami popísala intrón-dependentné intergénové regulačné obvody, ku ktorým dochádza medzi ribozomálnymi paralógmi a ktoré kontrolujú pomery ich expresie. V tejto práci sa nám nepodarilo potvrdiť prítomnosť takýchto obvodov u 6 zo 7 testovaných párov paralógov. Jedinou funkčnou je regulácia u RPL22 paralógov. Ukázali sme, že Rp22 proteín blokuje pre-mRNA zostrih oboch RPL22 paralógov, avšak prednostne RPL22B. Proteín Rpl22 to sprostredkováva väzbou na sekundárnu štruktúru v RPL22B intróne, pričom mutácia RNA-väzbovej domény proteínu Rpl22 vedie k strate väzby. Takáto sekundárna štruktúra a väzba na ňu je zachovaná aj v kvasinke Kluyveromyces lactis, ktorá obsahuje iba jednu kópiu RPL22 génu. Výsledky tejto práce vedú k lepšiemu porozumeniu intergénovej regulácie, ku ktorej dochádza medzi funkčne odlišnými RPL22 paralógmi. Kľúčové slová intróny, gény ribozomálnych proteínov, Rpl22, RPL22 paralógy, zostrih pre-mRNA, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
The role of pre-mRNA splicing in human hereditary diseases
Malinová, Anna
Malá jaderná ribonukleoproteinová částice U5 (U5 snRNP) je jednou z hlavních komponent spliceozomu, komplexu který katalyzuje sestřih pre-mRNA. U5 snRNP je tvořena molekulou RNA a několika proteiny, nicméně o tom jak jsou jednotlivé díly postupně skládány v maturovanou částici, se mnoho neví. Ukázali jsme, že po depleci proteinu PRPF8, jedné z klíčových složek U5 snRNP, se částice správně neskládají a akumulují se v jaderných strukturách zvaných Cajalova tělíska. K objasnění role PRPF8 v biogenezi U5 snRNP jsme se dále rozhodli využít mutace tohoto proteinu, které byly identifikovány u pacientů s degenerativním onemocněním oční sítnice, retinitis pigmentosa (RP). Vytvořili jsme stabilní buněčné linie exprimující mutantní varianty proteinu PRPF8 a ukázali jsme, že RP mutace narušují skládání U5 snRNP, což následně vede ke snížení efektivity sestřihu pre-mRNA v buňkách. Mutantní PRPF8 se spolu s proteinem EFTUD2 hromadí v cytoplazmě a vytvoření tohoto komplexu je zdá se prvním krokem skládání U5 snRNP. Dále jsme s využitím proteomických metod identifikovali řadu nových faktorů včetně komlexu HSP90/R2TP a proteinu ZNHIT2, které se váží na U5 snRNP. Naše výsledky ukazují, že tyto faktory preferenčně interagují...
|
|
|
The role of pre-mRNA splicing in human hereditary diseases
Malinová, Anna
Malá jaderná ribonukleoproteinová částice U5 (U5 snRNP) je jednou z hlavních komponent spliceozomu, komplexu který katalyzuje sestřih pre-mRNA. U5 snRNP je tvořena molekulou RNA a několika proteiny, nicméně o tom jak jsou jednotlivé díly postupně skládány v maturovanou částici, se mnoho neví. Ukázali jsme, že po depleci proteinu PRPF8, jedné z klíčových složek U5 snRNP, se částice správně neskládají a akumulují se v jaderných strukturách zvaných Cajalova tělíska. K objasnění role PRPF8 v biogenezi U5 snRNP jsme se dále rozhodli využít mutace tohoto proteinu, které byly identifikovány u pacientů s degenerativním onemocněním oční sítnice, retinitis pigmentosa (RP). Vytvořili jsme stabilní buněčné linie exprimující mutantní varianty proteinu PRPF8 a ukázali jsme, že RP mutace narušují skládání U5 snRNP, což následně vede ke snížení efektivity sestřihu pre-mRNA v buňkách. Mutantní PRPF8 se spolu s proteinem EFTUD2 hromadí v cytoplazmě a vytvoření tohoto komplexu je zdá se prvním krokem skládání U5 snRNP. Dále jsme s využitím proteomických metod identifikovali řadu nových faktorů včetně komlexu HSP90/R2TP a proteinu ZNHIT2, které se váží na U5 snRNP. Naše výsledky ukazují, že tyto faktory preferenčně interagují...
|
host ::
RSS.