|
|
Izolace nukleových kyselin pro diagnostické účely s využitím polymerních nosičů
Syslová, Ivona ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byla studována izolace kyseliny deoxyribonukleové (DNA) pomocí tří různých metod: fenolovou extrakcí, vysolováním chloridem sodným a magnetickou separací využívající reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na různé magnetické nosiče. K izolaci DNA bylo využito 5 různých vhodně funkcionalizovaných nosičů: magnetického silikagelu, P(HEMA-co-GMA) ox. I, P(HEMA-co-GMA) ox. II, Dynal DNA Direct a Perovskit 439. K reverzibilní imobilizaci DNA na nosič docházelo v prostředí vysoké koncentrace NaCl a poly(ethylenglykolu) (PEG). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA pomocí 2 M NaCl a PEG o molekulové hmotnosti 6000, kdy výsledná koncentrace PEG v separační směsi byla 8 a 16 %. Cílem bylo získat DNA v kvalitě vhodné pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR). DNA byla izolována z bakteriálních kultur tří sbírkových probiotických kmenů, L. amylovorus CCM 4380T, L. zeae CCM 7069 T, L. plantarum CCM 7039T, které byly kultivovány na médiu MRS. DNA byla rovněž izolována z fermentovaných mléčných výrobků: Jihočeský zákys s ovocem jahoda (kysaný mléčný výrobek s probiotickou kulturou Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Streptococcus thermophilus), Revital active (bílý jogurt s inulinem a probiotickou kulturou Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp.) a Actimel višeň (mléčný výrobek s obsahem probiotické kultury Lactobacillus casei). Po provedení PCR s izolovanou DNA byly PCR produkty detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy. Metodou PCR byla ověřena úspěšnost izolace DNA probiotických bakterií pomocí fenolové extrakce, vysolováním chloridem sodným i magnetickou separací s využitím různých magnetických nosičů. Metoda magnetické separace s využitím magnetických mikročástic byla také ověřena pro izolaci DNA v kvalitě vhodné pro PCR u probiotických kysaných mléčných výrobků.
|
|
|
Studium procesu agregace a fyzikální stability polymerních micel pomocí metody fluorescenční sondy
Chovancová, Romana ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Pomocí ring-opening polymerace poly(ethylenglykolu) (PEG) a poly(–kaprolaktonu) (PCL) byl syntetizován amfifilní blokový kopolymer poly(ethylenglykol)-b-poly(–kaprolakton) (PEG–PCL), jehož struktura a složení bylo stanoveno pomocí IR spektroskopie. Polymerní micely byly připraveny jak metodou za použití dialýzy proti vodě, tak přímým rozpuštěním kopolymeru ve vodě. Proces agregace a fyzikální stability polymerních micel ve vodě byl zkoumán pomocí fluorescenční spektroskopie za použití pyrenu a perylenu jako fluorescenčních sond. Z výsledků měření stacionární a časově rozlišené fluorescence bylo zjištěno, že daný systém tvoří ve vodě jak jednomolekulární, tak vícemolekulární agregáty, což závisí na jeho koncentraci. Hodnota kritické micelární koncentrace (CMC) tohoto diblokového kopolymeru byla stanovena na 0,002 g/L. Pomocí měření velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla bylo zjištěno, že s rostoucí koncentrací kopolymeru dochází k tvorbě větších agregátů. Nakonec bylo stanoveno chování kopolymeru za fyziologických podmínek v 0,15 mol/L roztoku soli při 37 °C, přičemž byla CMC tohoto systému stanovena na 0,02 g/L.
|
|
|
Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na magnetických nosičích
Šálek, Petr ; Ing.Daniel Horák, CSc. (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byla studována reverzibilní absorpce nukleových kyselina na magnetických mikročásticích za různých experimentálních podmínek. Byly použity magnetické mikročástice P(HEMA-co-GMA) a magnetické sklo. Cílem bylo získat kyselinu deoxyribonukleovou (DNA) v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA, což bylo dosaženo přidáním PEG a chloridu sodného do separační směsi. Byly použity PEG různé molekulové hmotnosti a to 600, 6000 a různá výsledná koncentrace PEG v separační směsi (4, 8, 12, 16%). K ověření podmínek adsorpce DNA byly použity modelové systémy : DNA z kuřecích erytrocytů a purifikovaná DNA bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06. S rostoucí molekulovou hmotností a výslednou koncentrací PEG vzrůstalo množství eluované DNA. Získané poznatky byly využity při izolaci DNA z hrubých lyzátů buněk čisté bakteriální kultury Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06 a při izolaci DNA z reálných vzorků (tekuté mléčné výrobky, tvrdý sýr). Přítomnost cílové DNA v eluátu byla ověřena pomocí rodově (rod Lactobacillus) nebo druhově specifické (druh Bifidobacterium longum) PCR. Dále bylo při separaci DNA z reálných vzorků (tekutých mléčných výrobků) ověřeno použití dvoufázového vodného systému se současnou adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice. Byly studovány podmínky tvorby dvoufázového vodného systému, který byl vytvořen 16% PEG o různé molekulové hmotnosti (600 a 6000 g/mol) a síranem amonným o různých koncentracích. Následně bylo zjišťováno, zda použití dvoufázového systému s adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice má vliv na citlivost stanovení cílové DNA bakterií mléčného kvašení v reálných vzorcích (tj. zda byl eliminován vliv inhibitorů PCR). Předpoklad o zvýšení citlivosti PCR byl potvrzen.
|
|
|
Izolace nukleových kyselin pro diagnostické účely s využitím polymerních nosičů
Syslová, Ivona ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byla studována izolace kyseliny deoxyribonukleové (DNA) pomocí tří různých metod: fenolovou extrakcí, vysolováním chloridem sodným a magnetickou separací využívající reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na různé magnetické nosiče. K izolaci DNA bylo využito 5 různých vhodně funkcionalizovaných nosičů: magnetického silikagelu, P(HEMA-co-GMA) ox. I, P(HEMA-co-GMA) ox. II, Dynal DNA Direct a Perovskit 439. K reverzibilní imobilizaci DNA na nosič docházelo v prostředí vysoké koncentrace NaCl a poly(ethylenglykolu) (PEG). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA pomocí 2 M NaCl a PEG o molekulové hmotnosti 6000, kdy výsledná koncentrace PEG v separační směsi byla 8 a 16 %. Cílem bylo získat DNA v kvalitě vhodné pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR). DNA byla izolována z bakteriálních kultur tří sbírkových probiotických kmenů, L. amylovorus CCM 4380T, L. zeae CCM 7069 T, L. plantarum CCM 7039T, které byly kultivovány na médiu MRS. DNA byla rovněž izolována z fermentovaných mléčných výrobků: Jihočeský zákys s ovocem jahoda (kysaný mléčný výrobek s probiotickou kulturou Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Streptococcus thermophilus), Revital active (bílý jogurt s inulinem a probiotickou kulturou Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp.) a Actimel višeň (mléčný výrobek s obsahem probiotické kultury Lactobacillus casei). Po provedení PCR s izolovanou DNA byly PCR produkty detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy. Metodou PCR byla ověřena úspěšnost izolace DNA probiotických bakterií pomocí fenolové extrakce, vysolováním chloridem sodným i magnetickou separací s využitím různých magnetických nosičů. Metoda magnetické separace s využitím magnetických mikročástic byla také ověřena pro izolaci DNA v kvalitě vhodné pro PCR u probiotických kysaných mléčných výrobků.
|
|
|
Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na magnetických nosičích
Šálek, Petr ; Ing.Daniel Horák, CSc. (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byla studována reverzibilní absorpce nukleových kyselina na magnetických mikročásticích za různých experimentálních podmínek. Byly použity magnetické mikročástice P(HEMA-co-GMA) a magnetické sklo. Cílem bylo získat kyselinu deoxyribonukleovou (DNA) v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA, což bylo dosaženo přidáním PEG a chloridu sodného do separační směsi. Byly použity PEG různé molekulové hmotnosti a to 600, 6000 a různá výsledná koncentrace PEG v separační směsi (4, 8, 12, 16%). K ověření podmínek adsorpce DNA byly použity modelové systémy : DNA z kuřecích erytrocytů a purifikovaná DNA bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06. S rostoucí molekulovou hmotností a výslednou koncentrací PEG vzrůstalo množství eluované DNA. Získané poznatky byly využity při izolaci DNA z hrubých lyzátů buněk čisté bakteriální kultury Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06 a při izolaci DNA z reálných vzorků (tekuté mléčné výrobky, tvrdý sýr). Přítomnost cílové DNA v eluátu byla ověřena pomocí rodově (rod Lactobacillus) nebo druhově specifické (druh Bifidobacterium longum) PCR. Dále bylo při separaci DNA z reálných vzorků (tekutých mléčných výrobků) ověřeno použití dvoufázového vodného systému se současnou adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice. Byly studovány podmínky tvorby dvoufázového vodného systému, který byl vytvořen 16% PEG o různé molekulové hmotnosti (600 a 6000 g/mol) a síranem amonným o různých koncentracích. Následně bylo zjišťováno, zda použití dvoufázového systému s adsorpcí kondenzované DNA na tuhé magnetické částice má vliv na citlivost stanovení cílové DNA bakterií mléčného kvašení v reálných vzorcích (tj. zda byl eliminován vliv inhibitorů PCR). Předpoklad o zvýšení citlivosti PCR byl potvrzen.
|
|
|
Studium procesu agregace a fyzikální stability polymerních micel pomocí metody fluorescenční sondy
Chovancová, Romana ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Pomocí ring-opening polymerace poly(ethylenglykolu) (PEG) a poly(–kaprolaktonu) (PCL) byl syntetizován amfifilní blokový kopolymer poly(ethylenglykol)-b-poly(–kaprolakton) (PEG–PCL), jehož struktura a složení bylo stanoveno pomocí IR spektroskopie. Polymerní micely byly připraveny jak metodou za použití dialýzy proti vodě, tak přímým rozpuštěním kopolymeru ve vodě. Proces agregace a fyzikální stability polymerních micel ve vodě byl zkoumán pomocí fluorescenční spektroskopie za použití pyrenu a perylenu jako fluorescenčních sond. Z výsledků měření stacionární a časově rozlišené fluorescence bylo zjištěno, že daný systém tvoří ve vodě jak jednomolekulární, tak vícemolekulární agregáty, což závisí na jeho koncentraci. Hodnota kritické micelární koncentrace (CMC) tohoto diblokového kopolymeru byla stanovena na 0,002 g/L. Pomocí měření velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla bylo zjištěno, že s rostoucí koncentrací kopolymeru dochází k tvorbě větších agregátů. Nakonec bylo stanoveno chování kopolymeru za fyziologických podmínek v 0,15 mol/L roztoku soli při 37 °C, přičemž byla CMC tohoto systému stanovena na 0,02 g/L.
|
host ::
RSS.