|
|
Monogenic susceptibility to infectious pathogens
Bloomfield, Markéta ; Šedivá, Anna (vedoucí práce) ; Koziar Vašáková, Martina (oponent) ; Litzman, Jiří (oponent)
(CZ) Moderní přístupy ke studiu monogenních vrozených poruch imunity, podpořené v posledních dekádách bezprecedentním rozvojem genetických metod, odkrývají nové, dosud neprobádané funkční aspekty imunitního systému. Nemoci s nápadným klinickým fenotypem, leč víceméně normálními základními imunologickými nálezy, jako jsou poruchy vrozené či intrinsické imunity se selektivně zvýšenou náchylností k jedinému infekčnímu agens, poskytují vzácnou příležitost ke studiu interakcí imunitního systému člověka s patogeny. Tato práce se zaměřuje na imunopatologické, genetické a klinické aspekty takových onemocnění, konkrétně na chronickou mukokutánní kandidózu způsobenou hypermorfními (gain-of-function, GOF) mutacemi ve STAT1 genu, které způsobují poruchy Th17 asociovaných imunitních mechanismů, a vrozenou náchylností k mykobakteriálním onemocněním (Mendelian susceptibility to mycobacterial diseases, MSMD) způsobenou poruchami signální dráhy IL-12, IL-23/IFNy. Práce dále přispívá k objasnění role IL-6 signalizace v protistafylokokové imunitě a zabývá se novým onemocněním dětského věku PIMS-TS (Paediatric inflammatory multisystem syndrome temporally associated with SARS-CoV-2), jako život ohrožujícím důsledkem imunopatologie spuštěné jediným konkrétním patogenem, který se s největší pravděpodobností vyvíjí v...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
|
|
Interaction of nucleic acids with RNA polymerase
Janoušková, Martina ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Knejzlík, Zdeněk (oponent)
Regulace genové exprese RNA polymerázou (RNAP) je nezbytnou schopností živých organizmů, která v konečném důsledku umožňuje jejich přežití. Interakce RNAP s nukleovými kyselinami (DNA nebo RNA) je pro transkripci a její regulaci rozhodující. Tato doktorská práce se zabývá dvěma projekty adresovanými k interakci RNAP s nukleovými kyselinami: (i) Transkripcí modifikovaných DNA templátů a (ii) Ms1, malou RNA, v M. smegmatis. (i) Zkoumali jsme vliv modifikací v malém žlábku DNA na bakteriální transkripci in vitro. Zjistili jsme, že transkripce modifikovaných DNA templátů je ovlivněna ve fázi iniciace transkripce a efekt modifikací je závislý na sekvenci promotoru. Dále jsme úspěšně provedli zapnutí a vypnutí transkripce in vitro pomocí bioortogonálních reakcí. Regulace transkripce pomocí umělých modifikací DNA má budoucnost v biotechnologiích a/nebo v medicíně. (ii) Dalšími regulátory genové exprese jsou malé nekódující RNA. Tuto důležitou roli mají tyto molekuly jak v prokaryotech, tak v eukaryotech. Ms1 je malá RNA nalezená v mykobakteriích tvořící komplex s jádrem RNAP. Ms1 se v buňkách nachází ve velkém množství ve stacionární fázi (množství Ms1 je porovnatelné s ribozomální RNA). Zkoumali jsme její syntézu a degradaci v M. smegmatis a došli jsme k závěru, že vysoké množství Ms1 ve stacionární fázi...
|
|
|
Regulation of expression of Ms1, a sRNA from Mycobacterium smegmatis
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
V průběhu růstu musí bakterie čelit různým vlivům prostředí, jako jsou změna teploty, nedostatek živin a jiné. Při adaptaci na nepříznivé podmínky dochází u bakterií k přizpůsobení genové exprese. Jedním typem regulace genové exprese je regulace pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Dobře studovanou bakteriální sRNA je 6S RNA, která se váže na holoenzym RNA polymerázy. Avšak tato RNA byla nalezena jen u některých druhů baterií. Jedním z druhů, které pravděpodobně nemají 6S RNA jsou mykobakterie. Místo toho byla u Mycobacterium smegmatis nalezena jiná malá RNA - Ms1. Ms1 má strukturu podobnou 6S RNA a skutečně byla původně nalezena jako strukturní homolog 6S RNA. Ukázalo se však, že Ms1 se neváže na holoenzym RNA polymerázy, ale váže se na jádro RNA polymerázy. Jedná se proto o malou RNA významně odlišnou od 6S RNA. Tato práce popisuje regulaci exprese Ms1. Z regulační oblasti před genem pro Ms1 byli připraveny promotorové fragmenty různé délky. Tyto fragmenty byly vloženy před reportérový gen lacZ. Aktivita těchto promotorů byla testována v exponenciální, časné a pozdní stacionární fázi růstu a v průběhu stresu. Na základě provedených experimentů byla určena sekvence promotorového jádra a regulační oblasti, do kterých by se mohl vázat transkripční faktor. Aktivita promotoru pro Ms1 se zvýšila při...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy
Šedivá, Kateřina ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Malátková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Kateřina Šedivá Školitel: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace mykobakteriální dihydrofolátreduktasy Dihydrofolátreduktasa je enzym nezbytný pro metabolismus kyseliny listové - katalyzuje redukci dihydrofolátu na tetrahydrofolát. Tetrahydrofolát je důležitým kofaktorem při reakcích přenášejících jednouhlíkaté zbytky. Hraje klíčovou roli v syntéze DNA, RNA a proteinů. Dihydrofolátreduktasa se nachází také u M. tuberculosis. Tato bakterie je nejčastějším původcem tuberkulózy u lidí. Právě dihydrofolátreduktasa by mohla být potenciálním cílem pro vývoj nových antituberkulotik. Rekombinantní protein dihydrofolátreduktasa byl připraven v několika krocích. Sekvence kódující protein byla nejprve amplifikována polymerásovou řetězovou reakcí. Ligací namnoženého úseku DNA a plazmidu pET-28b(+) vznikl rekombinantní plazmid, který byl metodou tepelného šoku transformován do kompetentních buněk E. coli kmen HB101. K expresi proteinu byly použity buňky E. coli kmen BL21(DE3). Samotná exprese byla indukována přidáním isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Získaný rekombinantní protein byl izolován a purifikován metodou afinitní chromatografie. Metodou dle Bradfordové...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
|
|
Mykobakteriální infekce domácích a volně žijících přežvýkavců
ROTHOVÁ, Kristýna
Rod Mycobacterium, zahrnuje velké množství zástupců, přičemž k nejvýznamnějším patří Mycobacterium bovis, původce tuberkulózy skotu a Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) infikující dobytek, volně žijící přežvýkavce a zvířata v zoologických zahradách, což vede ke střevnímu onemocnění paratuberkulóze. Infekce má chronický průběh, je progresivní a nereaguje na léčbu. Mnoho infikovaných zvířat nejeví klinické příznaky, ale mohou být zdrojem infekce. Klinicky nemocná zvířata jsou vyhublá a trpí těžkými průjmy, které v konečném stádiu vedou k úhynu. V průběhu onemocnění je MAP vylučováno trusem nebo mlékem. Paratuberkulóza není klasifikována jako zoonóza a možná rizika v oblasti veřejného zdraví jsou stále diskutována. Tuberkulózu skotu je onemocnění charakterizované progresivním vývojem charakteristických granulomů, v plicích, lymfatických uzlin nebo jiných orgánech. Toto onemocnění postihuje dobytek po celém světě a způsobuje velké ekonomické ztráty. Jedná se o dobře známou zoonózu, u níž rizika přenosu byla v rozvinutých zemích zmírněna díky zavedení pasterizace mléka. V České republice byla úspěšně eradikována v roce 1968, avšak riziko jejího zavlečení prostřednictvím dovozu zvířat, především do zoologických zahrad, stále trvá.
|
|
|
Laboratorní diagnostika mykobakterií se zaměřením na bakteriologický průkaz
VELKOVÁ, Martina
Laboratorní metody hrají důležitou roli v diagnostice onemocnění. I když jsou v současné době k dispozici rychlé molekulárně - genetické metody a metody založené na imunitní odpovědi organismu, základní vyšetřovací metodou přímého průkazu stále zůstává mikroskopický a kultivační průkaz. Mikroskopie je základní metodou pro většinu patologických vzorků, především pro sputum. Citlivost této metody není vysoká, přesto je důležitá. Umožňuje rychle odhalit rozsáhlá klinicky i epidemiologicky závažná onemocnění. U kultivačního průkazu se za ?zlatý standard? považuje kultivace na pevných vaječných půdách. V současné době bývá doplňována kultivací v automatickém detekčním systému, který urychluje dobu detekce. Tato práce byla prováděna v období 1.1. - 6.6. 2013 v Nemocnici Č. Budějovice a.s. v Laboratoři lékařské mikrobiologie, Pracoviště bakteriologie. Do studie bylo celkem zahrnuto 400 sput, které byly zpracovány a vyšetřovány. Cílem bylo ověřit a porovnat účinnost dekontaminačních metod za použití HCl a NALC. Zároveň byla sledována výtěžnost a doba detekce v klasické kultivaci a v automatickém detekčním systému BACTECTM MGITTM 960. Automatický systém využívá neradiometrickou fluorescenční technologii. Kultivace probíhá v tekutém Middlebrook 7H9 médiu s přídavkem antimikrobiálních látek (polymyxin B, amfotericin B, kyselina nalidixová, trimetoprim, azlocilin). U klasické kultivace byly použity pevné vaječné půdy: Löwenstein-Jensenova a půda podle Ogawy. Jednotlivé výsledky pak ukazují, že u metody s HCl byla kontaminace celkem u 1 % vzorků. Pro jednotlivé metody pak v 5 % v BACTECTM MGITTM 960 a 4 % v klasické kultivaci. Ve srovnání u metody s NALC byla kontaminace celkem u 21 % vzorků a z toho pro jednotlivé metody 26 % v BACTECTM MGITTM 960 a 50 % v klasické kultivaci. Z těchto výsledků je tedy patrné, že metoda s NALC má nižší účinnost, podíl kontaminace oproti metodě s HCL se zvýšil o 20 %. Dekontaminační metoda s NALC je doporučena výrobcem pro BACTECTM MGITTM 960. Byla ale shledána nevyhovující a nebylo v ní možné nadále pokračovat. Porovnáním výtěžnosti a doby detekce izolovaných kmenů u jednotlivých metod bylo prokázáno, že BACTECTM MGITTM 960 vykazuje větší citlivost než klasická kultivace, neboť ze 17 celkem izolovaných kmenů BACTECTM MGITTM 960 zachytil 15 oproti 10 izolovaným kmenům v klasické kultivaci. Patrný je i výrazně kratší čas detekce pozitivních vzorků. Průměrný čas detekce u BACTECTM MGITTM 960 byl 16,2 dní, zatímco u klasické kultivace 31 dní. Potvrdilo se, že systém BACTECTM MGITTM 960 dosahuje lepších výsledků, ale optimalizace je dosaženo kombinováním obou používaných metod. Ze zpracovaných statistických údajů za období 2010 - 2012 je patrný pokles, ale k výraznému snížení nedochází. Znatelný je pouze pokles Mycobacterium bovis BCG, což se dá vysvětlit tím, že očkování proti tuberkulóze není již od roku 2011 prováděno plošně, ale podle nové platné legislativy pouze u rizikových skupin. Zajímavou skutečností je i to, že každoročně je v laboratoři nejvyšší záchyt ve věkové skupině nad 60 let.
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.