|
|
Optimalizace metody real-time PCR pro kvantifikaci lidské mtDNA v klinických vzorcích
LOSKOT, Martin
Tato práce se zabývá stanovením mitochondriální DNA (mtDNA) a jejím významem v patologických stavech člověka. Mitochondrie patří mezi buněčné organely eukaryotických buněk, jsou důležité zejména pro jejich energetický metabolismus a mají významnou roli v procesu stárnutí a apoptózy. Podle recentních studií se mitochondriální dysfunkce kromě mitochondriálních onemocnění podílí také na běžných onemocněních, jako jsou nemoci srdce, mozku nebo rakovina. Ukazuje se, že počet mitochondrií v buňkách koreluje se zdravotním stavem a stárnutím organismu. Buněčný obsah mtDNA se často měří jako poměr mtDNA k jaderné DNA. Měření mtDNA z periferní krve se ukazuje jako vhodný ukazatel mitochondriálních funkcí, neboť snížené množství mtDNA může korelovat se sníženou funkcí mitochondrií. Dosud nebylo objasněno, jak hladina mtDNA ovlivňuje vznik onemocnění, ale ukazuje se, že by mohla být biomarkerem pro kontrolu zdravotního stavu v čase. Praktická část popisuje přípravu vzorků z bukálních stěrů a periferní krve a metodu stanovení mtDNA pomocí real-time PCR. Výpočet počtu kopií mtDNA z naměřených hodnot a jejich vyhodnocení. V rámci optimalizace měření je uvedeno srovnání dvou různých přístupů pro diagnostiku relativního počtu kopií mtDNA.
|
|
|
Molecular basis of deficit of F1Fo-ATP synthase and its impact on energy metabolism of a cell
Štufková, Hana ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Kuncová, Jitka (oponent) ; Janovská, Petra (oponent)
Hlavní funkcí mitochondrií je produkce energie prostřednictvím procesu oxidační fosforylace. ATP syntáza je makromolekulární rotační stroj lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně katalyzující syntézu adenosintrifosfátu (ATP) z adenosindifosfátu (ADP) a anorganického fosfátu (Pi). Mitochondrialní poruchy ATP syntázy představují heterogenní skupinu onemocnění charakterizovanou různou závažností klinického fenotypu s nástupem od narození nebo v pozdějších fázích života. Mutace v mitochondriální nebo jaderné DNA mohou vést k poruše ATP syntázy, a to buď izolovaně, nebo v kombinaci s defekty dalších komplexů systému oxidační fosforylace. Cílem práce bylo charakterizovat protein TMEM70, asemblační faktor ATP syntázy, a studovat vliv nových variant vedoucích k deficitu ATP syntázy v pacientských vzorcích. TMEM70 je 21 kDa velký protein vnitřní mitochondriální membrány s orientací obou konců do mitochondriální matrix, který tvoří v membráně vyšší oligomerní struktury. Naše výsledky ukázaly, že absence proteinu TMEM70 vede ke vzniku izolovaného deficitu komplexu V, s přítomností adaptačního/kompenzačního efektu komplexů dýchacího řetězce. Ve svalových mitochondriích byly pozorovány různé stupně deficitu ATP syntázy způsobené extrémně vzácnými heteroplazmatickými variantami v genu MT-ATP6. Zatímco...
|
|
|
Study of etiopathology of mitochondrial disorders
Rákosníková, Tereza ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Pecina, Petr (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Mitochondriální onemocnění představují klinicky, biochemicky i geneticky heterogenní skupinu dědičných onemocnění, jež prevalence je přibližně 1:5 000 živě narozených dětí. Společným znakem těchto onemocnění je narušení mitochondriálního energetického metabolismu. V současné době je známo více než 400 genů asociovaných s mitochondriálním onemocněním, avšak 45 % pacientů s podezřením na mitochondriální onemocnění je stále bez potvrzené genetické příčiny. Pomocí sekvenování nové generace nacházíme nové kandidátní geny anebo varianty, které by mohly stát za příčinou onemocnění. Abychom mohli potvrdit kauzalitu těchto nově nalezených genů a variant, je třeba charakterizovat deficit pomocí řady biochemických metod. Cílem této práce bylo studovat funkci proteinu ACBD3 na úrovni mitochondriálního energetického metabolismu v ne-steroidních buňkách HEK293 a HeLa a potvrdit tak kauzalitu genu ACBD3 u pacientky s kombinovaným deficitem systému oxidativní fosforylace (OXPHOS). Druhým cílem bylo potvrdit kauzalitu dvou nových variant v genech MT-ND1 a MT-ND5, kódujících strukturní podjednotky komplexu I (KI) dýchacího řetězce. Třetím cílem práce bylo studovat tvorbu superkomplexů u pacientů se vzácnými dědičnými metabolickými poruchami. V předkládané dizertační práci se podařilo pomocí funkční studie proteinu...
|
|
|
Low-temperature injury in insect tissues and mechanisms of its repair
ŠTĚTINA, Tomáš
Zatímco problematika fyziologických změn, která doprovází chladovou aklimaci hmyzu, byla relativně dobře prozkoumána v periodě před vystavením následnému chladovému stresu, procesům zotavení po vystavení chladovému stresu bylo věnováno mnohem méně pozornosti. K zachycení procesů probíhajících po vystavení chladovému stresu jsem použil širokého spektra technik fyziologických, molekulárně biologických a mikroskopických v larvách dvou druhů drosophilid - mrazově odolné Chymomyza costata a k mrazu náchylné Drosophila melanogaster. Několik útržků důkazů směřuje k narušené funkci mitochondrie v letálně mražených larvách. Mrazuvzdorný fenotyp C. costata si zachovává celistvost mitochondrie i po hlubokém zamražení.
|
|
|
Biogenesis, structure and physiological functions of mitochondrial ATP synthase
Eliáš, Jan ; Mráček, Tomáš (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Savčí mitochondriální ATP syntáza je enzym skládající se z 18 proteinových podjednotek, jenž se nachází ve vnitřní membráně mitochondrie. Její hlavní funkcí je využívat protonový gradient, který je utvářen komplexy respiračního řetězce (RCC), za účelem tvorby ATP. Vedle tvorby ATP je známo, že se dimery ATP syntázy podílejí na správné mitochondriální morfologii skrze tvorbu apexů krist. Dále bylo navrženo, že je rovněž zapojena ve fenoménu mitochondriální přechodné propustnosti, který má důležitou funkci v regulaci programované buněčné smrti. V posledních letech bylo na poli studia biogeneze savčí ATP syntázy dosaženo řady úspěchů. Proces jejího sestavování je nyní objasněn, nicméně poznatky o asemblačních faktorech periferního stonku a podjednotky c jsou stále neúplné. Právě za účelem zodpovězení těchto otázek na polích biogeneze a sekundarních rolí savčí ATP syntázy jsme vytvořili KO model katalytické β podjednotky F1 části savčí ATP syntázy (βKO). Tento model byl připraven na pozadí buněčné linie HEK293. Jeho následná charakterizace ukázala, že narušení F1 struktury enzymu vyústilo v nemožnost složení funkčního monomeru a došlo k rozpadu jednotlivých podjednotek. Jediným stabilním asemblačním intermediátem, jenž byl odhalen, byl oktamer podjednotky c, který oproti kontrole vykazoval zvýšenou stabilitu. V...
|
|
|
Molecular requirements of LACTB-induced tumor suppression
Jakoubě, Pavel ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Rohlenová, Kateřina (oponent)
LACTB je nedávno objevený tumor supresorový protein fungující v různých typech tkání. Zdá se, že mechanismus jeho působení je závislý na daném kontextu; LACTB dokáže potlačit vznik rakoviny skrze zastavení buněčného cyklu, navození apoptózy, diferenciace či potlačení epiteliálně-mezenchymální přechodu. Tyto procesy mohou dále záviset na změnách v metabolismu lipidů či na interakci s dalšími tumor supresory a signálními drahami. LACTB je odvozený od bakteriálních proteinů vázajících penicilin, lokalizuje do mezimembránového prostoru mitochondrií a má vlastní enzymatickou aktivitu. Také se ukázalo, že tvoří filamenty, které se sestávají ze dvou antiparalelních řetězců a o nichž se předpokládá, že by mohly mít jistou funkci v organizaci mezimembránového prostoru mitochondrií. V první části této diplomové práce jsem pokusil zmapovat molekulárními požadavky pro vznik LACTB filament, s akcentem na roli disulfidických můstků v jejich tvorbě. V druhé části jsem se snažil odhalit interakční partnery LACTB, jež by rovněž mohli sehrávat určitou roli při tvorbě filament. Splnění těchto cílů nám může poskytnout hlubší porozumění biologické aktivitě LACTB a také odhalit podmínky pro jeho správné sbalení. Klíčová slova: LACTB, tumor supresory, rakovina, struktura, disulfidické můstky, interakce proteinů
|
|
|
Characterization and modulation of MitoTam-induced cell death in breast carcinoma cells
Hrysiuk, Mariia ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
Poslední roky sice přinesly mnoho průlomových objevů v protirakovinném výzkumu a terapiinádorovýchonemocnění, jako je rakovina prsu (RP), tyto však stále představují jednu z hlavních zdravotních hrozeb na celém světě. Rakovinné buňky obvykle získávají rezistenci vůči aktivaci regulované buněčné smrti (RBS), jako je na kaspázách závislá apoptóza. Mezi nová látky indukující RBS patří také do mitochondrií cílený tamoxifen - MitoTam, na který se tato práce zejména zaměřuje. V panelu RP buněk jsme určili jejich profily energetických (mitochondriální respirace vs. glykolýza) drah a expresi vybraných proteinů souvisejících s RBS (Western blotting) a pomocí časosběrného monitorování buněčným analyzátorem Lumascopem LS 720 jsme analyzovali jejich citlivost na MitoTamem aktivovanou RBS. Zjistili jsme, že buňky RP preferující glykolýzu jako MDA-MB-231 jsou odolnější vůči MitoTamu než na mitochondríální respiraci vice závislé MDA-MB-453. Většina testovaných RP buňky však může být zcitlivěna k MitoTamem indukované RBS BH3mimetiky, jako je na BCL-XL cílený A1155463 a některými sloučeniny modulujícími buněčný metabolismus, jako je inhibitor laktátdehydrogenázy (R)-GNE-140, zejména v preinkubačním módu. Také další sloučeniny modulující metabolismus, jako je inhibitor pyruvátdehydrogenázových kináz JX06, významně...
|
|
|
Modulační působení kmenových buněk na buňky imunitního systému zprostředkované mitochondriálním transferem
Somova, Veronika ; Krulová, Magdaléna (vedoucí práce) ; Balounová, Jana (oponent)
Kmenové buňky využívají různých mechanismů mezibuněčné komunikace k modulaci imunitní odpovědi. Jedním z mechanismů je mitochondriální transfer, který indukuje metabolické změny, podporuje přežívání a mění fenotyp imunitních buněk, avšak málo je známo o mechanismech přenosu mitochondrií do různých buněčných populací a osudu mitochondrií v buňce-příjemci. Tato práce měla za cíl popsat mechanismus a modulační působení mitochondriálního transferu. Byly zkoumány faktory, které můžou přenos mitochondrií ovlivňovat: tvorba ROS, apoptóza, funkčnost mitochondrií. Dále byl popsán vliv mitochondriálního transferu na přežívání imunitních buněk a mitofagie. V neposlední řadě se tato práce soustředila na porovnání schopnosti mezenchymálních kmenových buněk a Sertoliho buněk přenášet mitochondrie. Mezenchymální kmenové buňky se ve většině případů ukázaly jako zdatnější v přenosu mitochondrií než Sertoliho buňky. Byly rovněž pozorovány velké rozdíly v přítomnosti mitochondrií z mezenchymálních kmenových buněk nebo Sertoliho buněk v námi zvolených populacích splenocytů. Proto byl podrobněji zkoumán vliv kyslíkových radikálů na přenos mitochondrií, který se jednoznačně nepotvrdil. Je ale potřeba vyzdvihnout roli mitofagie, která se, dle získaných výsledků, zdá být důležitá jak před, tak po přenosu mitochondrií do...
|
|
|
Hodnocení mitochondriální produkce superoxidů indukované antibiotiky u adherentních buněk
Ingrová, Kateřina ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Zumberg, Inna (vedoucí práce)
Teoretická část bakalářské práce obsahuje popis vlivu reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) na oxidační stres u mitochondrií a následky použití antibiotik při kultivaci buněčných linií. Buněčnou linii studovanou v této bakalářské práci je buněčná linie mezenchymálních kmenových buněk (MSCs). V praktické části je popsán postup provedeného experimentu – pasážování, kultivace a barvení buněk. Navržený experiment byl zopakován s dostatečným počtem opakování. Nasnímané snímky konfokálním mikroskopem byly zpracovány v programovacím prostředí MATLAB.
|
|
|
Mitochondriální produkce kyslíkových radikálů a její úloha ve fyziologických regulacích
Holzerová, Eliška ; Mráček, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
Produkce kyslíkových radikálů v mitochondriích a z ní plynoucí oxidativní stres je významným fenoménem dlouhodobého výzkumu a též předmětem diskusí. Poznání, jak přesně jsou kyslíkové radikály produkovány a jaký mechanismus k této tvorbě vede, by mohlo napomoci přímému ovlivnění jejich produkce s potenciálem pro využití v terapii. U některých enzymů je již molekulární podstata produkce kyslíkových radikálů dobře popsána, u jiných však přetrvávají kontroverze a současné teorie jsou zřejmě daleko od pravdy. Mnohem zajímavější se pak jeví otázka fyziologické důležitosti této produkce. Dlouhou dobu byly totiž kyslíkové radikály považovány za jednoznačně škodlivé faktory narušující celistvost organismu. Novější výzkumy ale naopak naznačují, že jejich existence může být též přínosná a účelná. Prokazatelně totiž mohou sloužit jako signalizační molekuly v některých metabolických a regulačních drahách probíhajících v organismu. Tato bakalářská práce nabízí nahlédnutí do současného stavu znalostí. Zaměřuje se na co nejpodrobnější popis produkce reaktivních forem kyslíku enzymy mitochondriálního dýchacího řetězce. Dále pak se zabývá některými signálními kaskádami, u kterých byl prokázán podíl mitochondriální tvorby kyslíkových radikálů. Klíčová slova: mitochondrie, enzymy dýchacího řetězce, reaktivní formy...
|
host ::
RSS.