|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Role of cytoskeleton in plant cell morphogenesis
Miklánková, Pavlína ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Sekereš, Juraj (oponent)
Bunky sú schopné nadobúdať nepreberné množstvo tvarov, v čom hrá dôležitú úlohu cytoskelet. Ovplyvňuje depozíciu materiálov bunečnej steny, reguluje pohyb vačkov po bunke, podieľa sa na exocytóze a endocytóze. Kortikálne mikrotubuly ovplyvňujú ukladanie celulózy do bunečnej steny a tým udávajú smer bunečnej expanzie, hoci presný súvis medzi mikrotubulami a celulózou zostáva nevyjasnený. Aktín podporuje rast a prispieva k jeho priestorovej regulácii vo vrcholovo aj difúzne rastúcich bunkách. Je dôležitý pri sekrécii v expandujúcich bunkách, ale jeho presné funkcie pri riadení bunečného rastu nie sú ešte celkom vysvetlené. Pre lepšie pochopenie, ako spolu súvisia aktínový a mikrotubulárny cytoskelet v morfogenéze rastlinných buniek, sa používajú analýzy mutantov, spektroskopické metódy, cytoskeletárne jedy, fluorescenčné proteíny a ďalšie metódy. Dobrým modelom pre výskum sú epidermálne a trichómové bunky Arabidopsis thaliana, na ktorých prebieha väčšina štúdii.
|
|
|
Hledání mechanismů a funkce interakce mikrotubulárního cytoskeletu s dalšími složkami v rostlinné buňce
Krtková, Jana ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent) ; Ovečka, Miroslav (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet se v rostlinných buňkách účastní mnoha důležitých dějů během dělení, růstu a vývoje. Výkon jeho četných funkcí je však umožněn interagujícími proteiny, které jednak modulují jeho dynamiku a organizaci, jednak umožňují funkční či strukturní propojení s dalšími složkami rostlinné buňky. Identifikace zprostředkovatelů těchto interakcí a jejich fyziologická funkce za specifických podmínek byla hlavní náplní předkládané dizertační práce. Pomocí biochemických metod byly identifikovány membránové proteiny, které zároveň kosedimentují s mikrotubuly. Překvapivě mezi nimi nebyli žádní zástupci klasických konzervovaných proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAP), ale jednalo se o enzymy, chaperony a rostlinně specifické proteiny. Pro další studium jeho role související s rostlinnými mikrotubuly byl vybrán identifikovaný heat-shock protein 90 (Hsp90_MT). Rekombinantní Hsp90_MT se váže přímo na mikrotubuly a dimery tubulinu in vitro. Za vazbu není zodpovědná jeho ATP-vazebná doména. Hsp90_MT v BY-2 kolokalizuje s mikrotubuly fragmoplastu i s kortikálními mikrotubuly a podílí se na obnově mikrotubulů po jejich depolymeraci způsobené chladem. Dále se Hsp90 účastní postupu buněčného cyklu, jeho inhibice u rostlinných buněk blokuje buněčný cyklus v G1 fázi. Na základě literárního studia...
|
|
|
MAPs, proteiny asociované s mikrotubuly v rostlinných buňkách
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
1. Abstrakt a klíčová slova Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur. Jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny, které můžeme zahrnout do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Výzkum MAP a jejich různorodých funkcí se v posledních letech prudce rozvíjí. Některé MAP ovlivňují dynamiku MT, jiné mají spíše strukturní funkci - propojují jednotlivá MT vlákna s rozličnými buněčnými strukturami, jako jsou ostatní MT, proteiny, organely, aktinový cytoskelet či plasmatická membrána. Mnoho popsaných MAP proteinů má homology v rámci celé eukaryotické říše, příkladem je rodina MAP65 nebo EB1 (END BINDING 1), je proto zajímavé sledovat, zda a jak se rostlinné MAP svými funkcemi liší od svých živočišných homologů. Na druhou stranu jsou popsány také rostlinně specifické MAP s unikátními funkcemi v rostlinné buňce, například ATK5 či SPR1 (SPIRAL 1). Tato bakalářská práce je literární rešerší, jejímž cílem je zpracovat přehled rostlinných MAP, charakterizovat je a popsat, pokud jsou známy, jejich funkce z hlediska buňky i celého rostlinného organismu. Klíčová slova: cytoskelet, mikrotubuly, proteiny asociované s mikrotubuly, rostlinná buňka, růst a vývoj
|
|
|
Analýza lokalizace endomembránových markerů v kortikální vrstvě rostlinných buněk a jejich interakce s komplexem Arp2/3
Jelínková, Barbora ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
ARP2/3 je evolučně konzervovaný heterohemptamerický proteinový komplex. Jeho hlavní aktivitou je nukleace větvených aktinových vláken za účelem remodelace membrán. ARP2/3 se účastní remodelace plazmatické membrány a tvorby cytoplazmatických výběžků sloužících k pohybu u živočišných buněk a améboidních prostist a účastní se exocytózy a endocytózy u živočichů a kvasinek. Cílem této práce bylo pokusit se najít souvislost komplexu ARP2/3 s regulací endomembránového systému u rostlin. Pomocí TIRF mikroskopie byla prozkoumána lokalizace komplexu ARP2/3 v kortikální vrstvě rostlinných buněk a porovnána s lokalizací endomembránových markerů ze skupiny Rab a exocytotickým markerem Exo84b. Podjednotky komplexu ARP2/3 lokalizovaly v blízkosti plazmatické membrány do dynamických teček nejvíce se podobajících lokalizaci Exo84b proteinu. Kolokalizační analýza ukázala malou míru kolokalizace signálu Exo84b a ARP2/3 a tento výsledek byl podpořen biochemickým přístupem koimunoprecipitace. Klíčová slova: ARP2/3, endomembránový systém, kortikální vrstva, RabA1g, RabC1, RabD2a, Exo84b,
|
|
|
Regulatory mechanisms of centrosomal microtubule nucleation
Klebanovych, Anastasiya ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
SOUHRN Organizace a dynamika mikrotubulů se mění s ohledem na potřeby buňky při jejím růstu, dělení a diferenciaci, a také při vnitrobuněčném transportu i přenosu signálů. Centrozomální mikrotubuly se tvoří pomocí γ-tubulinových komplexů (γTuRC). Ačkoliv signální dráhy regulující mikrotubulární nukleaci zůstávají do značné míry neznámé, posttranslační modifikace stavebních proteinů γTuRC a jejich interakčních partnerů hrají důležitou úlohu při modulaci nukleace. V předkládané disertační práci jsme funkčně charakterizovali úlohu protein tyrosin fosfatázy SHP-1 a E3 UFM-protein ligázy 1 (UFL1) interagující s proteinem CDK5RAP3 (C53) při regulaci centrozomální mikrotubulární nukleace. Rovněž jsme v tomto procesu objasnili roli profilinu 1, regulačního proteinu aktinových filament. Zjistili jsme, že SHP-1 v žírných buňkách kostní dřeně (BMMC) tvoří komplexy s γTuRC proteiny a inhibuje nukleaci mikrotubulů snížením množství γ-tubulinu/γTuRC v centrozómech. Navrhli jsme nový mechanismus, při kterém aktivní centrozomální Syk kináza, fosforylovaná na tyrosinu a regulovaná SHP-1, moduluje nukleaci mikrotubulů během aktivace BMMC pomocí antigenu. Poprvé jsme ukázali, že proteinový komplex UFL1/C53 se může podílet na regulaci nukleace mikrotubulů. Protein C53, jehož množství je regulováno UFL1, se váže na centrozómy....
|
|
|
Mechanismy dynamiky a nukleace mikrotubulů v rostlinné buňce
Mauerová, Zdeňka ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Žárský, Viktor (oponent)
Nukleace mikrotubulů spoluurčuje organizaci této složky cytoskeletu v buňkách a význač- ným dílem přispívá k utváření její dynamiky. V rostlinných buňkách se uplatňuje přede- vším na preexistujících mikrotubulech závislá nukleace, která se odehrává v kortikální oblasti a také v rámci dělícího vřeténka a fragmoplastu. Rekrutování γTuRC, univerzál- ního konzervovaného nukleátoru, na stěnu mikrotubulů zajišt'uje augmin ve spolupráci s NEDD1/GCP-WD. Funkce γTuRC je přinejmenším při nukleaci ve vřeténku, ale zřejmě i v ostatních případech dále posilována XMAP215/MOR1, který zvyšuje jeho efektivitu svojí polymerační aktivitou, a TPX2, eventuálně jeho homology, jenž jednak komplex přímo aktivuje, jednak tvorbou kondenzátu s tubulinovými dimery lokálně navyšuje jejich koncen- traci, což také zvyšuje pravděpodobnost úspěšného uskutečnění nukleace. O regulačních drahách kontrolujících tento proces se toho příliš neví, s výjimkou TTP komplexu činného v kortexu. Celkově jsou znalosti o nukleaci v rostlinách spíše skrovné a informace týkající se molekulárních mechanismů fungování uvedených faktorů pocházejí převážně z výzkumu na živočišných modelech. Klíčová slova augmin, cytoskelet, γTuRC, mikrotubuly, nukleace, rostlinná buňka
|
|
|
MAP code and regulation of microtubule-based processes
Karhanová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Tomášová, Štěpánka (oponent)
Proteiny asociované s mikrotubuly (MAPs) jsou považovány za klíčové regulátory molekulárního transportu v buňkách. Ačkoli jejich nesprávné fungování vede k závažným patologiím, jako jsou neurodegenerativní poruchy, regulační role těchto proteinů zůstávají nejasné. Jelikož se MAPs váží na cytoskelet, musí být tato struktura pro funkci MAPs zásadní. Mikrotubulům, vysoce dynamickému typu cytoskeletální struktury, byla věnována zvláštní pozornost kvůli jeho asociaci s buněčným dělením a vitálními funkcemi v neuronech. Mikrotubuly mohou projít post-translačními úpravami, které ovlivňují molekulární motory a také vazbu dalších proteinů, jako jsou MAPs. Doposud není dostatečně zdokumentováno, jestli post-translační úpravy mikrotubulů regulují distribuci MAPs. Ukázalo se však, že MAPs spolupracují na vytváření soudržných obalů na mikrotubulech a regulují přístup molekulárních motorů a enzymů rozdělujících mikrotubuly. Jelikož existuje mnoho typů MAPs a ty se vzájemně vylučují, objevila se nedávno v literatuře hypotéza regulačního ‚MAP kódu '. Pomocí dostupné literatury se tato práce pokusí představit nový model MAP kódu a poskytnout některé základní informace o předchozím výzkumu v tomto tématu.
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
The role of anillin in the growth cone of neurons
Tomášová, Štěpánka ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
Axony nově vznikajících neuronů se musí během embryonálního vývoje správně propojit, aby vytvořily fungující neurální síť. Pro tento účel slouží růstový kónus, vysoce dynamická struktura na konci rostoucích axonů, která zajišťuje navigaci i samotný pohyb. Pro správné hledání cesty je nutná komunikace mezi aktinem a mikrotubuly. Přesný mechanismus takové kooperace však dosud není objasněn. Tato diplomová práce studuje možnou roli proteinu anillinu v tomto procesu. Anillin byl studován ve dvou lidských buněčných liních. V SH-SY5Y neuroblastomové linii byla provedena transgenní overexprese a siRNA knock-down. Zvýšení exprese anillinu v SH-SY5Y buňkách vedlo k vzniku poškozených neuritů, zatímco buňky se sníženou expresí tvořily méně neuritů. Dále byly studovány neurony diferencované z lidských iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), ve kterých se exprimuje endogenní fluorescenčně značený anillin. Zde byly pozorovány lokální dynamické shluky anillinu na bázi dynamických výběžků diferencujících se neuronů. Shluky se objevovaly zejména během migrace, iniciace nových neuritů, ale také v čerstvě vzniklých růstových kónech. Tyto výsledky nasvědčují tomu, že anillin hraje roli v zakládání neuritů lidských neuronů. Pro odhalení přesné funkce anillinu v těchto buňkách bude třeba další práce.
|
host ::
RSS.