|
|
Izolace DNA z rostlinných tkání pro použití v polymerázové řetězové reakci
Trojánek, Zdeněk ; RNDr.Roman Matyášek, CSc. (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Extrakce nukleových kyselin je důležitým krokem pro všechny molekulárně-biologické studie. Proces izolace rostlinné DNA je komplikovaný vzhledem k přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a jiných metabolitů, které mohou být izolovány současně s DNA a působit jako inhibitory PCR. Cílem této práce bylo porovnat mezi sebou klasickou metodu izolace rostlinné DNA – metoda CTAB, komerční kit DNeasy Plant Mini Kit, přímou homogenizaci, polymerní neporezní magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami a kombinaci výše uvedených metod pro izolaci DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu. DNA izolovaná jednotlivými metodami byla hodnocena z hlediska množství, čistoty a použití v PCR. Všechny metody poskytly DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Nicméně jednotlivé metody vykazovaly rozdíly v množství a čistotě izolované DNA, pracnosti izolace DNA a ceně. Kombinací přímé homogenizace a magnetických nosičů pokrytých karboxylovými skupinami byla izolována DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, PCR v reálném čase a restrikční analýzu. Tato metoda je časově nenáročná, jednoduchá a nevyžaduje práci se škodlivými látkami.
|
|
|
Izolace DNA z probiotických druhů baktérií mléčného kvašení v potravinových doplňcích
Tvrdíková, Jana ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V této práci byly testovány magnetické nosiče funkcionalizované streptavidinem při selektivní izolaci DNA. Metoda selektivní izolace DNA byla testována s využitím DNA probiotického kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 211/06. Na nosiče s navázaným streptavidinem byl imobilizován biotinylovaný oligonukleotid a využit jako DNA sonda pro izolaci komplementárního řetězce DNA pomocí DNA/DNA hybridizace. Jako DNA sonda byl testován primer R 5´ bio a biotinylovaný denaturovaný PCR produkt specifický pro druh Lb. paracasei. Byly optimalizovány následující experimentální podmínky selektivní izolace DNA: teplota a doba hybridizace, množství DNA, eluce DNA z mikročástic. Izolace DNA byla ověřena pomocí PCR s rodově specifickými primery. Byl amplifikován rodově specifický PCR produkt o velikosti 250 bp, který byl prokázán pomocí gelové elektroforézy na agaróze. Použitý postup byl úspěšně použit při selektivní izolaci DNA Lactobacillus z komplexního vzorku doplňku stravy (BIFI pangamin).
|
|
|
Identifikace bakterií mléčného kvašení v kysaných mléčných výrobcích s využitím amplifikačních metod
Tycová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Polymerázová řetěžová reakce (PCR) je molekulární diagnostická metoda, která umožňuje identifikaci bakterií mléčného kvašení používaných v potravinářském průmyslu. V této práci byla použita PCR pro identifikaci bakterií druhu Streptococcus thermophilus v 10-ti náhodně vybraných komerčně dostupných kysaných mléčných výrobcích a pro identifikaci druhu Streptococcus thermophilus v 25 lyofilizátech kmenů získaných ze Sbírky mlékařských kultur Laktoflóra (CCDM, Tábor, CZ). Druhově specifické PCR primery byly cíleně vybrány z oblastí 16S rDNA. PCR produkty (968bp) byly detekovány použitím elektroforézy na 1,2 % agarózovém gelu. Bakteriální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk magnetickými nosiči P(HEMA-co-GMA) obsahujícími karboxylové skupiny. DNA byla vratně navázána na jejich povrch v přítomnosti vysoce koncentrovaného polyethylenglykolu (PEG 6000) a chloridu sodného. Metoda fenolové extrakce DNA byla použita jako kontrolní. Pomocí metody PCR byly identifikovány bakterie druhu Streptococcus thermophilus ve v všech analyzovaných vzorcích.
|
|
|
Využití magnetických mikročástic pro izolaci DNA
Jelínek, Zdeněk ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V rámci diplomové práce byla studována efektivita magnetických mikročástic při izolaci DNA bakteriálního kmene Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T a DNA z kuřecích erytrocytů. K izolaci byly použity magnetické mikročástice na bázi HEMA, pokryté karboxylovými skupinami, a hypersíťované styren-divinylbenzenové částice (Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Praha). Jako kontrola byly použity komerční magnetické mikročástice Dynabeads® DNA DIRECT™ Universal (Dynal, Norsko) na bázi polystyrenu a částice MPG® Uncoated (PureBiotech, USA) na bázi magnetického skla. Sledována byla závislost množství izolované DNA na výchozí koncentraci DNA v roztoku a závislost množství izolované DNA na koncentraci magnetických mikročástic. Rovněž byla sledována afinita magnetických mikročástic k RNA a to pro různé výchozí koncentrace RNA v roztoku. Testované nosiče byly použity při izolaci DNA z reálného vzorku (mléčný výrobek Actimel). Kvalita separované DNA rodu Lactobacillus byla prokázána pomocí rodově specifické PCR.
|
|
|
Srovnání různých typů magnetických nosičů při mikroizolaci DNA z potravin
Koplík, Jerguš ; Lunerová,, Jana (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Byl optimalizován postup mikroizolace DNA v kvalitě pro PCR z vybraných čerstvých a sušených semen luštěnin a potravinových výrobků obsahujících luštěniny (humus). Pro optimalizaci byly použity magnetické mikročástice PGMAox a optimální navážka rostlinných a potravinových materiálů byla zvolena 200 mg. Pro čerstvé rostlinné materiály byl zvolen izolační postup zahrnující použití lyzačního roztoku s CTAB o objemu 500 L, 1 L -merkaptoethanolu a 500 L směsi chloroform-oktanol. Pro izolaci DNA ze sušených semen luštěnin a potravinových výrobků byl navýšen objem lyzačního roztoku s CTAB na 1 000 L. Pro dosažení vyšší čistoty DNA byly některé připravené homogenáty přesráženy isopropylalkoholem. Optimalizovaný proces izolace DNA byl použit při přípravě homogenátu z potravinových výrobků, ze kterých byla izolována DNA různými magnetickými nosiči. Pro srovnání magnetických nosičů byly použity neporézní nosiče poly(glycidylmethakrylát) PGMAox, poly(2-hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) P(HEMA-co-GMA)ox, pokryté karboxylovými skupinami a porézní hypersíťované mikročástice poly(styren-co-divinylbenzen) HPS-B-M-22-NH2, magnetické porézní sklo MPG a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) PLL. V průměru nejvyšší koncentrace a nejlepší čistota DNA byla izolována použitím magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA)ox a PGMAox.
|
|
|
Magnetické nosiče a jejich praktické využití
Chlopková, Barbora ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Teoretická část shrnuje dosavadní poznatky pro praktické využití magnetických nosičů v molekulární diagnostice. Zahrnuje jak již používané metody, tak i metody s potenciálním využitím do budoucna. V experimentální části bylo testováno využití magnetických nosičů pro izolaci DNA z mléčného výrobku a bakteriální kultury. Bylo potvrzeno, že magnetickými nosiči byla izolována DNA v kvalitě a množství vhodném pro provedení polymerázové řetězové reakce.
|
|
|
Použití PCR v reálném čase pro charakterizaci nosičů používaných pro izolaci DNA
Ondrejková, Martina ; Šálek, Petr (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická časť diplomovej práce bola zameraná na magnetické nosiče zložené z magnetického jadra pokrytého polymérnou vrstvou, využívané prevažne v medicínskych, molekulárno-biologických a biochemických aplikáciach. Enkapsulácia jadra je pre uvedené aplikácie podstatná z dôvodu zníženia nešpecifickej adsorbcie proteínov, zvýšenia biokompatiblity a možnej funkcionalizácie magnetických nosičov. V experimentálnej časti práce bola amplifikovaná DNA (E.coli) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (PCR v reálnom čase) v prítomnosti magnetických nosičov pokrytých kopolymérom polyhydroxymetakrylátom-glycidylmetakrylátom (P(HEMA-co-GMA)) s obsahom alebo bez obsahu karboxylových funkčných skupín. Inhibičný efekt magnetických nosičov rôznej koncentrácie v PCR zmesi bol vyhodnocovaný z hodnôt parametrov kalibračných priamok získaných regresnou analýzou. Prítomnosť špecifického produktu PCR bola overovaná agarózovou gélovou elektroforézou. Väčšina magnetických nosičov bez obsahu karboxylových skupín zhášala fluorescenciu v rozsahu koncentrácií 2,0 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi, inhibícia amplifikácie DNA sa nepreukázala a sú teda biokompatibilné. Magnetické nosiče s obsahom karboxylových skupín zhášali fluorescenciu už pri nižších koncentráciách, v rozsahu 0,4 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi. Bola preukázaná ich inhibícia amplifikácie v rozsahu koncentrácií 2,0 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi, od koncentrácie0,8 g.l-1 v PCR zmesi inhibícia nenastala a nosiče sú biokompatibilné. Výsledky nezáviseli od charakteristických vlastností magnetických nosičov ale od prítomnosti karboxylových skupín na povrchu nosiča a stupňa pokrytia magnetického jadra polymérom. PCR v reálnom čase sa preukázala ako účinný nástroj pre štúdium enkapsulácie magnetického jadra a vplyvu funkčných skupín na povrchu polymérnej vrstvy.
|
|
|
Izolace bakteriální DNA z potravin s využitím magnetických nosičů
Bubeníková, Lucia ; Horák, Daniel (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na selektivní izolaci bakteriální DNA pomocí magnetických nosičů se streptavidinem (PGMA-NH2-STV, MPG® Streptavidin). Byly optimalizovány podmínky funkcionalizace nosičů dvěma biotinylovanými sondami: množství nosiče, množství sondy, vazba biotinylové sondy na streptavidin. Pro hybridizaci byla použita purifikovaná DNA Lactobacillus. Byla testována vazba DNA na sondu (DNA/DNA hybridizace) a nespecifická vazba DNA na částice. Cílová DNA, eluovaná z nosiče, byla identifikována pomocí PCR s primery R16-1 a LbLMA1-rev a s primery P_eub a F_eub. Množství sondy navázané na nosič bylo stanoveno spektrofotometricky. Bylo zjištěno, že k funkcionalizaci lze použít biotinylovanou sondu o koncentraci 5 pmol/µl, přidávanou k nosiči v poměru nosič:sonda 1:1. Bylo ukázáno, že nespecifická adsorpce DNA na nosič MPG® Streptavidin je výrazně menší než na nosič PGMA-NH2-STV. DNA/DNA hybridizací s využitím nosiče MPG® Streptavidin byla izolována DNA z čisté kultury Lactobacillus. Postup byl aplikován na izolaci DNA z mléčných výrobků.
|
|
|
Reverzibilní imobilizace DNA na nově syntetizovaných magnetických nosičích
Kubisz, Petr ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce byla optimalizace izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) s využitím reversibilní adsorpce nukleových kyselin na povrch magnetických nosičů pokrytých funkčními skupinami. K izolaci DNA bylo ověřováno použítí 6 nosičů: P(HEMA-co-GMA) ox, F-kol B 30 ox, F-kol 77 ox, F-kol B100 ox, F-kol 135 ox, pokrytých karboxylovými skupinami a Perovskit 439 (pokrytý silikagelem). Bakteriální DNA byla izolována metodou fenolové extrakce. DNA byla ze vzorků na magnetický nosič reversibilně navázána v prostředí vysoké koncentrace NaCl (5 M) a poly (etylenglykolu) (PEG 6000) o konečné koncentraci 16 % v separační směsi. DNA byla eluována do TE pufru. Kvalita izolované DNA magnetickými částicemi byla ověřená pomocí amplifikace v PCR. Bylo zjištěno, že i když magnetickými nosiči bylo izolováno různé množství DNA, kvalita izolované DNA byla vždy v kvalitě vhodné pro PCR. Nanočástice Perovskit 439 měly proti ostatním magnetickým nosičům nejlepší separační vlastnosti a bylo jimi izolováno největší množství DNA. Pro jejich další využití při analýze reálných vzorků je však třeba tyto částice i metodu izolace dále optimalizovat.
|
|
|
Identifikace bakterií mléčného kvašení v tvrdých sýrech s využitím amplifikačních metod
Herzogová, Jitka ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na identifikaci bakterií mléčného kvašení druhu Lactococcus lactis a poddruhů Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris pomocí druhově a subdruhově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR). Metoda PCR byla použita k identifikaci bakterií druhu Lactococcus lactis v 10 vzorcích tvrdých sýrů. Byl vypracován postup přípravy vzorků tvrdých sýrů pro získání dostatečného množství buněk a přípravu hrubých lyzátů buněk. Celková DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována použitím magnetických částic P(HEMA-co-GMA) v přítomnosti polyethylenglykolu (PEG 6000) a chloridu sodného. Jako kontrola izolace byla použita DNA izolovaná metodou fenolové extrakce. PCR byla rovněž použita k analýze 7 kmenů Sbírky mlékařských mikroorganismů Laktoflora (CCDM). U těchto kmenů bylo subdruhově specifickou PCR prokázáno zařazení 5 kmenů do poddruhu Lactococcus lactis ssp. lactis a 2 kmenů do poddruhu Lactococcus lactis ssp. cremoris.
|
host ::
RSS.