|
|
In search of DUSP specificity
Sladeček, Stanislava ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Martínková, Natália (oponent)
Duálně specifické fosfatázy (DUSP) jsou enzymy, které defosforylují fosfoserinové/threoninové a fosfotryrozínové zbytky na jednom substrátu. Většina z nich specificky defosforyluje rodinu mitogeny-aktivovaných protein kináz (MAPK). Počet DUSPů se zvyšuje u složitějších organismů a v lidském genomu je 25 popsaných DUSPů. Některé DUSPy mohou defosforylovat pouze jeden protein, zatímco jiné interagují s širším spektrem substrátů. S výjimkou substrátové specificity se DUSPy liší v expresii, subcelulární lokalizaci atd. Přestože byly první DUSPy popsány asi před 20 lety, doposud není popsaný žádný zřejmý faktor zodpovědný za jejich substrátovou specifitu. Předložená diplomová práce se snaží použitím in silico metod objasnit a popsat společné vlastnosti a rozdíly DUSPů, které mohou být důležité pro určování jejich specificity. Klíčová slova: fosfatázy, kinázy, DUSP, MAPK, substrátová specificita, konzervovanost aminokyselinových zbytků, fylogenetický strom, in silico metody
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Objasnění vlivu proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace nezávislé na čepičce
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Proteinkinázy ERK1 a ERK2 jsou jedny z nejstudovanějších proteinů buněčné signalizace. Oba proteiny se podílejí na velkém množství procesů ať už fosforylací proteinových substrátů nebo aktivací proteinkináz, které jsou součástí dalších signálních drah. Enzymy ERK1 a ERK2 jsou součástí MAPK/ERK signální kaskády, která je spojována s mnoha buněčnými ději, jakými jsou například buněčná proliferace, buněčný růst nebo diferenciace. Signální kaskáda MAPK/ERK je často silně aktivována v různých typech rakovinných bujení a je jedním z cílů vývoje nízkomolekulárních inhibitorů v léčbě nádorových onemocnění. Jednou z hlavních otázek základního výzkumu proteinů ERK1 a ERK2 je rozdílnost obou proteinkináz. Přestože mnohé poznatky poukazují na redundanci těchto proteinů, objevují se i poznatky tvrdící opak. Nedávná publikace skupiny Casanova et al. 2012 nepřímo poukazuje na rozdílný vliv proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace, která není závislá na čepičce, nýbrž na vnitřním vazebném místě pro ribozom, IRES. V Laboratoři biochemie RNA se už dlouho zabýváme iniciací translace zprostředkovanou HCV IRES (z ang. Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site, Vnitřní vazebné místo pro ribozomu viru žloutenky typu C). Tato diplomová práce vedla k zavedení metody RNA interference v naší laboratoři a vytvoření...
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Studium interakcí ASK1 kinasy s thioredoxinem.
Koláčková, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
MAP kinasová signalizační kaskáda hraje důležitou roli při vzniku buněčných odpovědí na různé stresové podněty z vnějšího prostředí. Tato signalizační kaskáda je třístupňová: MAP kinasy kinasy kinasy (MAP3K) fosforylací aktivují MAP kinasy kinasy (MAP2K) a ty následně fosforylují a tím aktivují MAP kinasy (MAPK), čímž regulují spoustu buněčných funkcí jako je apoptosa, buněčné dělení či morfogenese. Jednou z důležitých MAP3K je proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1), která je důležitým regulátorem imunitních a stresových buněčných odpovědí. Vzhledem k tomu, že zvýšená aktivita ASK1 souvisí s rozvojem závažných onemocnění, jako jsou např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je ASK1 zajímavým cílem ve farmacii při vývoji nových léčiv. Lidská ASK1 sestává z 1374 aminokyselin a dělí se na tři domény: centrální Ser/Thr katalytickou doménu a dvě coiled-coil domény, z nichž první se nachází na N- a druhá na C-konci molekuly této proteinkinasy. ASK1 je regulována pomocí svých vazebných partnerů, mezi které patří také malý celulární redoxní protein thioredoxin (Trx-1), který se váže na N-terminální část ASK1. Trx-1 je silným antioxidantem a chrání tak buňky před toxickými podněty z okolí. Mechanismus regulace aktivity ASK1 pomocí Trx-1 je jedním z nejvíce...
|
|
|
Příprava a charakterizace katalytické domény lidské proteinkinasy ASK1.
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1) patří do rodiny mitogeny aktivovaných proteinkinas kinas kinas (tzv. MAP3K) a hraje důležitou roli v imunitních a stresových odpovědích. Vzhledem k souvislosti mezi její zvýšenou aktivitou a rozvojem nemocí jako např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je tato bílkovina perspektivní cíl pro vývoj léčiv. Celý enzym se skládá z 1374 aminokyselinových zbytků (lidská ASK1), ale katalyticky aktivní je pouze Ser/Thr kinasová doména nacházející se přibližně uprostřed molekuly. Aktivita ASK1 je regulována prostřednictvím interakcí s různými proteiny včetně proteinu 14-3-3. Tento protein se váže na fosforylovaný serinový zbytek ASK1 v pozici 966 na C-konci katalytické domény. Tato vazebná interakce má za následek inhibici ASK1 prostřednictvím zatím neznámého mechanismu. Při stresovém signálu, nejčastěji při oxidativním stresu, se ASK1 na Ser966 defosforyluje a protein 14-3-3 disociuje. Rozpad komplexu ASK1:14-3-3 je jedním z dějů, které vedou k aktivaci ASK1. Cílem této práce byla příprava komplexu katalytické domény ASK1 s proteinem 14-3-3 pro následné studium interakcí těchto dvou proteinů. Oba proteiny byly úspěšně exprimovány v buňkách E. coli a purifikovány. Dále byly připraveny i různé mutantní formy obou těchto...
|
|
|
ERK1/2 MAP kináza - její strukturní charakteristika a interakční partneři
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Žíla, Vojtěch (oponent)
Mimobuněčné signální molekuly jsou rozpoznávány membránovými receptory na povrchu eukaryotických buněk. Receptory přenáší signál do vnitrobuněčného prostoru, kde dochází k aktivaci příslušných enzymů. Aktivovanými enzymy mohou být proteinkinázy, které fosforylují substrátové proteiny odpovídající potřebám pro specifické rozpoznání proteinkinázou. Substrátovými proteiny mohou být strukturní proteiny a enzymy, které dále přenáší signál nebo přímo ovlivňují fyziologické procesy buňky. Mezi proteinkinázy patří i ERK1 a ERK2 (Kináza regulovaná mimobuněčným signálem 1 a 2), enzymy které mají vliv na buněčný růst, buněčný cyklus a další řadu fyziologických procesů buňky. Proteinkináza je dynamická molekula, která během katalytického cyklu podstupuje řadu konformačních změn. Konformační změny mají vliv na stabilitu a funkci molekuly. Konzervované aminokyselinové zbytky naplňují funkci proteinkináz. Tyto faktory se zároveň podílí na interakci s proteinovými substráty a regulačními proteiny a jsou tak zodpovědné za specifickou funkci proteinkinázy.
|
host ::
RSS.