|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Moderní metody studia protein-proteinových interakcí
Křivková, Jana ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kučerová, Jitka (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají nepostradatelnou roli ve všech procesech v živých buňkách. Pochopení interakcí mezi proteiny nám umožňuje bližší popis buněčných dějů a jejich pochopení otevírá nové možnosti i pro návrh léčiv. Důležitost otázky studia PPI se odráží v recentním rozvoji různorodých metod pro jejich identifikaci a popis. Cílem této práce je sumarizovat poznatky o nových a zdokonalených experimentálních metodách identifikace a charakterizace proteinových interakcí. Metody popsané v této práci jsou členěny do čtyř kapitol, metody blízkostí indukovaného značení proteinů (BioID, BioID2, APEX, TurboID, MiniTurbo, PUP-IT, AirID, SPPLAT, EMARS), využití síťování proteinů pro jejich identifikaci a strukturní charakterizaci (XL-MS), fluorescenční metody identifikace a vizualizace (BiFC, FRET, BRET) a biofyzikální metody pro stanovení kinetických či termodynamických parametrů interakce (SPR, ITC, MT).
|
|
|
Studium nově objeveného proteinu GL50803_16424 u Giardia intestinalis.
Pelc, Josef ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Pyrih, Jan (oponent)
Anaerobní jednobuněčný eukaryotický organismus Giardia intestinalis je celosvětově rozšířený střevní parazit člověka a zvířat. Způsobované onemocnění giardióza je jednou z nejčastějších parazitárních infekcí ve vyspělých částech světa. G. intestinalis je také zajímavá svými unikátními buněčnými znaky. Jedním z nich je přítomnost mitosomů, speciálních organel odvozených od mitochondrií. Podobně jako mitochondrie je mitosom ohraničen dvěma membránami a má stejný způsob transportu proteinů. Nicméně mitosom nemá vlastní genom a doposud je známá pouze jedna mitosomální metabolická dráha - syntéza železo-sirných klastrů. Za použití in vivo enzymatického značení bylo identifikováno několik nových mitosomálních proteinů včetně GL50803_16424. Naši pozornost upoutal protein GL50803_16424 tím, že interagoval s proteiny všech mitosomálních subkompartmentů: vnější membránou, vnitřní membránou a matrix. Navíc exprese proteinu GL50803_16424 značeného HA tagem vedla k tvorbě neobvyklých struktur v blízkosti mitosomů, které nebyly dříve pozorovány. Bioinformatické přístupy ukázaly, že GL50803_16424 má doménu podobnou "myelodysplasia-myeloid leukemia factor 1-interacting protein". Naše data z hmotnostní spektrometrie ukazují, že protein GL50803_16424 interaguje s proteiny endoplazmatického retikula a mitosomu. Úzké...
|
|
|
Candida parapsilosis secreted aspartic proteinases: processing and secretion
Vinterová, Zuzana ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Szotáková, Barbora (oponent)
Candida parapsilosis je lidský oportunní patogen, jehož klinický význam vzrůstá, a který způsobuje širokou škálu potencionálně život ohrožujících infekcí u jedinců s oslabeným imunitním systémem. Jedním z nejvýznamějších virulenčních faktorů kvasinek Candida je produkce sekretovaných aspartátových proteas (Saps). Předkládaná disertační práce se zabývá převážně studiem sekretované aspartátové proteasy 1 (Sapp1p) kvasinky C. parapsilosis, jejím procesem aktivace a sekrece za různých podmínek a s využitím různých experiemntálních modelů. Sapp1p je sekretovaná buňkami C. parapsilosis do mimobuněčného prostoru se zcela odštěpeným pre-pro-peptidem a plně proteolyticky aktivní. Pokusy studující buněčnou stěnu C. parapsilosis prokázaly prodlouženou přítomnost zcela aktivované proteasy na buněčném povrchu (CW-Sapp1p). Metoda pro měření enzymové aktivity Sapp1p provedená na neporušených buňkách ukázala, že CW-Sapp1p je proteolyticky aktivní ještě před svým uvolněním do mimobuněčného prostoru a je schopná štěpit substrát. Pokusy s biotinylací a následnou analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie ukázaly, že biotinylace CW-Sapp1p je proces saturovatelný, jehož výsledkem ale nejsou plně naznačené molekuly. Přístupnost jednotlivých lysinových zbytků byla v molekule Sapp1p proměnlivá s výjimkou čtyř zbytků, které...
|
|
|
Biosensors for Environmental Monitoring and Biomedical Applications
ŠTOFIK, Marcel
Study of biosensors has become an essential part of research in biotechnology. Biosensors as fast, portable, highly sensitive, and low-cost bioanalytical detection devices have been utilized in many fields of human activity. The first part of the presented work focuses on electrochemical biosensors for rapid environmental screening of herbicides as water pollutants. A sol-gel immobilization method for a photosystem II (PSII) complex is studied in order to enhance the sensitivity and the signal strength and stability of a PSII-based biosensor. Computer simulations of a PSII biosensor are employed with the aim to find out how the immobilization membrane properties influence the biosensor parameters. Newly developed immobilization by a thin-layer membrane based on the results of computer simulations and revised measurement protocols are presented. The second part of the work is devoted to synthesis and electrochemical detection of newly developed metal labels for electrochemical immunosensors. The synthesis of dendrimer-encapsulated silver nanoparticles and biorecognition properties of biotin-nanocomposite conjugates are discussed. For detection of synthesized labels, a microfluidic detector was manufactured and tested and different approaches to packing of a microfluidic chip employing polydimethylsiloxane (PDMS) were investigated. Newly designed microstructures for a microfluidic separator of magnetic beads (MBs) were studied by computer simulations. The separator was made and trapping of MBs for the further employment in MBs-based immunoassays are presented
|
host ::
RSS.