|
|
Příprava lidského a schistosomálního kathepsinu L v enzymaticky aktivní formě
Horáková, Lenka ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Kathepsinové proteasy typu L se účastní řady patologických procesů a jejich inhibitory jsou atraktivními molekulami pro vývoj nových léčiv. Diplomová práce se zabývá lidským kathepsinem L (hCL) a kathepsinem L3 z parazitické krevničky střevní (Schistosoma mansoni) (SmCL3). hCL je spojován s nádorovými onemocněními a Covid-19, zatímco SmCL3 je trávicím enzymem S. mansoni způsobující onemocnění schistosomózu. Cílem diplomové práce byla příprava rekombinantních kathepsinů L v enzymaticky aktivní formě citlivé k inhibitorům. V případě hCL byly identifikovány podmínky pro řízenou autoaktivaci prekurzorových forem na zralou formu enzymu a optimalizovat tento proces závislý na pH a teplotě. V případě SmCL3 byl navržen protokol pro purifikaci zralé formy z expresních médií kvasinky Komagataella pastoris. Senzitivita připraveného hCL a SmCL3 k inhibici byla ověřena pomocí modelového peptidomimetického vinylsulfonu, jehož hodnoty IC50 byly v oblasti sub/nanomolárních koncentrací. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, funkční proteomika, rekombinantní exprese proteinů, struktura proteinů
|
|
|
Rekombinantní exprese a funkční charakterizace rostlinných Kunitzových inhibitorů
Rybáriková, Renata ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
PDI (z angl. "potato cathepsin D inhibitor") a NID (z angl. "novel inhibitor of cathepsin D") z lilku brambor (Solanum tuberosum) patří do proteinové rodiny Kunitzových inhibitorů (rodina I3 podle databáze Merops). Tyto isoinhibitory s molekulovou hmotností cca 20 kDa a typickou prostorovou architekturou β-trojlístku inhibují aspartátové a serinové peptidasy. Byly připraveny konstrukty pro rekombinantní expresi PDI a NID v kvasinkovém expresním systému Pichia pastoris a vybrány kolonie pro jejich účinnou produkci. Oba proteiny byly identifikovány v kultivačním médiu pomocí hmotnostní spektrometrie a N-koncového sekvenování. Pro PDI byl navržen isolační protokol se třemi chromatografickými kroky. Purifikovaný rekombinantní PDI byl porovnán s nativním PDI z přírodního zdroje a byly prokázány analogické funkční vlastnosti. Analýza inhibiční specifity dále ukázala, že PDI inhibuje vybrané aspartátové peptidasy rodiny A1 a serinové peptidasy rodiny S1 včetně relevantního enzymu hmyzího původu. To podporuje hypotézu o funkci Kunitzových inhibitorů jako obranných molekul rostlin proti herbivornímu hmyzu. Připravené inhibitory budou využity pro analýzu reaktivních center proti cílovým peptidasám pomocí proteinové krystalografie. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, aspartátové a serinové...
|
|
|
Příprava a biochemická charakterizace proteasového inhibitoru equistatinu
Polatová, Daniela ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Equistatin ze sasanky koňské (Actinia equina) obsahuje proteinovou doménu Eqd2, která inhibuje aspartátové peptidasy, ale dosud nebyla detailně charakterizována. Rekombinantní Eqd2 byl připraven v kvasinkovém expresním systému a byl navržen protokol pro jeho chromatografickou purifikaci. Pomocí fluorescenčního inhibičního testu byla určena inhibiční specifita Eqd2, která ukázala, že je vysoce selektivním inhibitorem peptidas typu katepsinu D a pepsinu z rodiny aspartátových peptidas A1. Dále byla pomocí gelové chromatografie analyzována tvorba komplexu Eqd2-peptidasa a oligomerizace Eqd2 v roztoku. Za účelem budoucí rentgenostrukturní analýzy Eqd2 byla provedena primární analýza krystalizačních podmínek. Tato práce přináší nové významné informace o Eqd2 jako unikátním typu přirozených inhibitorů aspartátových peptidas. Lze předpokládat, že určení interakčního mechanismu Eqd2 umožní navrhovat jeho syntetická mimetika pro regulaci medicinálně významných peptidas. Klíčová slova: peptidasové inhibitory, proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, rekombinantní exprese, purifikace proteinů, krystalizace proteinů, equistatin
|
host ::
RSS.