|
|
The foundation of maternal factors in sturgeon: from oocyte to embryo
POCHERNIAIEVA, Kseniia Kostyantynivna
Pokles početnosti divokých populací jesetera v posledních desetiletích vedl k rostoucímu zájmu o využití různých biotechnologických postupů vedoucích k ochraně nebo obnově těchto ohrožených druhů. Produkce chimér, transplantace zárodečných buněk nebo produkce pomocí tzv. "náhradního rodiče" by mohly rozšířit spektrum technik používaných k záchraně druhu či vést k obnově rybích populací. Úspěšná aplikace těchto metod u jeseterů vyžaduje znalost jeho embryonálního vývoje a informace o struktuře a charakteristikách samotného jeseteřího oocytu. K odhalení intracelulární geometrie, morfogenetických aspektů, mechanismů organizace mateřských determinantů a jejich pozdější reorganizace byly v rámci této práce použity techniky qPCR tomografie, inhibice transkripce a vizualizace jader. qPCR tomografie se ukázala jako spolehlivá technika pro stanovení úlohy genů detekovaných v animalní a vegetativní hemisféře oocytů jesetera a také pro identifikaci profilů těchto genů u ranných vývojových stádií embryí jesetera. qPCR tomografie byla v zásadě provedena ve dvou krocích: předběžné kroky tomografie a samotná RT-PCR. Optimálně orientované oocyty byly rozřezány na 30 ?m a sekce (prokrývající jak animalní tak vegetativní pól), u který byla následně provedena celková extrakce RNA. 12 vybraných maternálních genů: [actb, ppia, alas1, sdha, ywhae, dnd, vasa, vegt, wnt11, ddx25, otx1 a gdf1] bylo sledováno pomocí RT-PCR. Identifikovány byly dvě skupiny transkriptů klasifikovaných jako animalní nebo vegetativní geny s jasným gradientem. Primární geny zárodečné plasmy - markery jako dnd, vasa, ddx25 byly lokalizovány směrem k vegetativnímu pólu. To vysvětluje, kde presně se nachází prapohlavní zárodečné buňky v oocytech jesetera malého. Dalším aspektem použití této techniky byla srovnávací analýza profilů RNA v oocytech drápatky Xenopus laevis a jesetera malého Acipenser ruthenus. Byla zjištěna jednoznačná podobnost v lokalizaci molekul mRNA u těchto dvou druhů. Takovéto podobnosti v expresních profilech vzdáleně příbuzných druhů naznačují, že jejich dávní předkové mohli vzniknout z více příbuzných linií. alpha-Amanitin jako transkripční inhibiční faktor byl použit ke stanovení zygotického genomového přechodu v embryích jesetera malého. Přechod z mateřského na zygotický typ transkripce je charakterizován eliminací mateřských transkriptů a pokračuje produkcí zygotických transkriptů. U jesetera malého byl tento přechod identifikován po desátém štěpení - během pozdní blastuly, kdy počet buněk v blastomeře překročil 1000. Morfologické změny během přechodu mid-blastuly představují milníky ve vývoji metazoanů, protože každá buňka přenáší perfektní kopii svého genomu v každé divizi. Embrya vzniklá křížením jiker jesetera malého A. ruthenus a spermatu jesetera ruského Acipenser gueldenstaedtii druhů s odlišnou ploidní úrovní byla vytvořena za účelem zvýšení obsahu DNA v jádrech buněk. Nukleární vizualizace barvením 4'-6-diaminido-2-fenylindolem (DAPI) ukázala, že se buňky dělí synchronně konstantní rychlostí až do MBT v devátém buněčném cyklu u kontrolních embryí, která odpovídají 1000 buněčnému stadiu (13 hpf). Hybridní embrya jesetera malého a ruského vykazovala přechod od synchronního k asynchronnímu dělení v osmém buněčném cyklu, což je stadium 512 buněk (12 hpf). U jesetera malého i hybridních embryí došlo k přechodu během 1 hodiny. Embrya jesetera injikovaného alpha-Amanitinem také vykazovala kinetiku buněčného cyklu podobnou kontrolám, a to bez zpoždění nebo malformace během štěpení, což s největší pravděpodobností naznačuje, že MBT u jesetera probíhá nezávisle na začátku produkce zygotických transkriptů.
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ráb, Petr (oponent) ; Marec, František (oponent)
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Časo-prostorové utváření molekulárních gradientů v časném embryonálním vývoji Xenopus laevis.
Flachsová, Monika
Detailní pochopení vývoje nového jedince zavisí na objasnění časo- prostorových mechanismů, které určují tělní plán. Z tohoto důvodu klíčovou otázkou časného embryonálního vývoje obratlovců stále zůstává, kdy a jak dochází k determinaci a diferenciaci jednotlivých buněk, což posléze vede ke specifikaci tělní osové polarity a založení základů všech orgánů a tkání. Odpověď na tuto otázku přinese nové možnosti využití nejen pro primární výzkum, ale i pro obor aplikované medicíny. Hlavní cíl předkládané disertační práce spočíval ve stanovení časo- prostorových molekulárních gradientů buněčných determinantů v průběhu časného embryonálního vývoje. Jako modelový organismus byla zvolena africká drápkatá žába, druh Xenopus laevis, která disponuje dostatečně velkými oocyty a vnější embryogenezí. Vzhledem k pozdní aktivaci embryonálního genomu se předpokládá, že stěžejní mechanismus počáteční determinace buněk závisí na nerovnoměrné lokalizaci maternálních faktorů uvnitř oocytu a jejich asymetrické distribuci do dceřiných blastomer v průběhu rýhování. Pomocí metody qPCR tomografie byly identifikovány dva hlavní lokalizační gradienty s preferencí buď v animální, nebo vegetativní hemisféře zralého oocytu. Tyto gradienty se shodovaly jak pro maternální mRNA, tak i pro miRNA molekuly. U maternální mRNA navíc...
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
The role of nitric oxide during embryonic wound healing and regeneration
Abaffy, Pavel ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Studium mechanismů, které kontrolují hojení, je velice atraktivní oblastí biologie a medicíny. Hojení ran se obvykle dělí na dva základní typy. Prvním je hojení dospělých jedinců, které je pomalé a končí jizvou. Druhým je hojení embryí, které je velmi rychlé a bez vzniku jizvy. Hojení je složitý proces, který zahrnuje mnoho kroků a je regulován velikým množstvím různých druhů molekul. Jednou z důležitých molekul je oxid dusnatý (NO), jehož funkce je často spojována s regulací zánětu a angiogeneze v průběhu hojení u dospělých jedinců. Tato práce se zabývá popisem úlohy NO v průběhu hojení časných embryí, která ještě nemají vyvinutý imunitní a cévní systém. Bylo pozorováno, že vysoká koncentrace NO je produkována v průběhu prvních 30 minut po poranění od stádia blastuly po plovoucího pulce. Úlohou NO je hlavně regulace exprese genů, které jsou spojené s odpovědí na stres a souvisejí s buněčným metabolismem. Dopady produkce NO během hojení jsou však pozorovatelné i několik hodin po uzavření rány v námi nově popsané třetí fázi embryonálního hojení. Ve třetí fázi probíhá remodelace poraněné tkáně a NO reguluje expresi a aktivitu matrix metaloproteináz a migraci naivních buněk imunitního systému do místa poranění. Předkládaná práce ukazuje na nový mechanismus působení NO v procesu embryonálního hojení a...
|
|
|
Vliv alelických variant transportéru ABCG2 na transport kyseliny močové
Vávra, Jiří ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ježek, Petr (oponent)
Kyselina močová je u člověka a vyšších primátů hlavním metabolitem vznikajícím degradací purinů. Její zvýšená hladina v séru, tzv. hyperurikemie, může být příčinou vzniku dny a dalších souvisejících chorob. Pro řízení urikemie mají vliv četné transportní proteiny, které se nacházejí v epitelu proximálního tubulu ledvin. Při poruše činnosti některého z nich může tedy být narušena hladina kyseliny močové v krvi. Celogenomovými GWAS studiemi bylo zjištěno, že často bývá při těchto patologických stavech postihnut transportér ABCG2, který se za normálních okolností podílí na secernaci kyseliny močové do moči. Cílem práce je, na modelu nematurovaných oocytů žáby Xenopus laevis, ověřit in vitro schopnost alelických variant ABCG2 přenášet kyselinu močovou. Tyto alelické varianty pocházejí z celogenomových studií provedených Revmatologickým ústavem při 1.LF v Praze. Transport kyseliny močové bude srovnán s wild type variantou transportéru. Klíčová slova: Kyselina močová, GWAS studie, Xenopus Laevis, membránové transportéry, ABCG2
|
|
| |
|
|
Časo-prostorové utváření molekulárních gradientů v časném embryonálním vývoji Xenopus laevis.
Flachsová, Monika
Detailní pochopení vývoje nového jedince zavisí na objasnění časo- prostorových mechanismů, které určují tělní plán. Z tohoto důvodu klíčovou otázkou časného embryonálního vývoje obratlovců stále zůstává, kdy a jak dochází k determinaci a diferenciaci jednotlivých buněk, což posléze vede ke specifikaci tělní osové polarity a založení základů všech orgánů a tkání. Odpověď na tuto otázku přinese nové možnosti využití nejen pro primární výzkum, ale i pro obor aplikované medicíny. Hlavní cíl předkládané disertační práce spočíval ve stanovení časo- prostorových molekulárních gradientů buněčných determinantů v průběhu časného embryonálního vývoje. Jako modelový organismus byla zvolena africká drápkatá žába, druh Xenopus laevis, která disponuje dostatečně velkými oocyty a vnější embryogenezí. Vzhledem k pozdní aktivaci embryonálního genomu se předpokládá, že stěžejní mechanismus počáteční determinace buněk závisí na nerovnoměrné lokalizaci maternálních faktorů uvnitř oocytu a jejich asymetrické distribuci do dceřiných blastomer v průběhu rýhování. Pomocí metody qPCR tomografie byly identifikovány dva hlavní lokalizační gradienty s preferencí buď v animální, nebo vegetativní hemisféře zralého oocytu. Tyto gradienty se shodovaly jak pro maternální mRNA, tak i pro miRNA molekuly. U maternální mRNA navíc...
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ráb, Petr (oponent) ; Marec, František (oponent)
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
host ::
RSS.