|
|
Vliv cytosolické nukleotidázy cN-IIIB na imunitní odpověď u \kur{Drosophila melanogaster}
DOLEJŠKOVÁ, Tereza
Adenosin je klíčovou signální molekulou metabolického přesmyku, stěžejního procesu metabolických změn u Drosophila melanogaster při infekci parazitoidní vosičkou. Ovšem veškeré cesty vzniku adenosinu nejsou doposud známé. V této práci jsme studovali potenciální konvertor AMP na adenosin v imunitní odpovědi, cN-IIIB, cytosolickou nukleotidázu, o které je známo, že přijímá methylovaný RNA cap nukleotid 7-methylguanosin jako substrát a chrání buňky před nežádoucí inkorporací tohoto nukleotidu do nukleových kyselin. Tuto vlastnost považujeme za potenciálně také důležitou v metabolickém přesmyku.
|
|
| |
|
|
Význam signální dráhy insulinu ve fyziologii klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
KOZELKOVÁ, Tereza
Tato diplomová práce se zabývá analýzou insulin receptorové dráhy v klíštěti Ixodes ricinus. Klíšťata jsou obligátní krev sající ektoparazité, přenášející mnoho patogenů jako jsou bakterie, viry a protozoa. Parazité jsou závislí na svých hostitelích skrze příjmu živin pro přežití, vývoj a rozmnožování. Insulin receptorová dráha je silně konzervovaná a reguluje širokou škálu fyziologických a anabolických procesů v závislosti na dostupných živinách. Cílem mé práce bylo ověření funkce komponent insulin receptorové dráhy. Tyto komponenty byly identifikovány ve střevním transkriptomu, konkrétně insulin receptor (IrInR), protein kináza B tzv. AKT (IrAKT) and IrTOR. Dále byla zhodnocena exprese jednotlivých genů v průběhu sání a po plném nasátí pomocí qRT-PCR. V této diplomové práci byl dále posouzen fenotyp po RNAi umlčení, injikování insulin receptor antagonistou (IRA) a umělém krmení klíšťat AKT a TOR inhibitory. Dále byl posouzen vliv imunizace králíků IrInR rekombinantním proteinem na následnou infestaci klíšťat.
|
|
|
Exploration of the tick-Borrelia molecular interactions by employing the transcriptomic approaches
MAHMOOD, Sazzad
Along with climate change and increased sharing of habitat, ticks are coming into more frequent contact with humans. The hard tick Ixodes scapularis and Ixodes ricinus are known disease vectors in Northern America and Europe, respectively. Along with many other pathogenic microorganisms, these ticks spread Borrelia sp. by ectoparasitic blood feeding. Borrelia afzelii is the major European Lyme disease pathogen spread by I. ricinus. Our study focuses on differential gene expression in I. ricinus salivary gland and midgut, induced in the nymphal stage by B. afzelii infection. Tick genes upregulated by infection are considered to play essential roles for the acquisition, persistence, and transmission of Borrelia. We have determined 32,897 full length sequences of tick mRNA from B. afzelii infected/noninfected tick salivary glands and the whole body. In addition, we have obtained MACEseq (Massive Analysis of cDNA Ends) from both midgut and salivary glands while the nymphs were non-infected or infected with B. afzelii during three different phases of blood-feeding. From the MACE database, we obtained 250-500 bp 3'-end sequences with raw quantitative expression values. Total reads, unique sequences and protein coding tick genes from midgut samples were 38,199,641, 88,825 and 24,276, and from salivary gland were 74,651,134, 93,096 and 26,179, respectively. After filtering, using several criteria, expression was validated by qPCR. Hence, the validated genes may most likely interact with Borrelia in its acquisition, persistence, or transmission to the vertebrate host. In our study, RNA interference approaches and vaccination were implemented in order to investigate the impact of upregulated tick midgut and salivary gland genes on Borrelia transmission to C3H mice.
|
|
|
RNA interference u rostlin
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kulich, Ivan (oponent)
RNA interference je jedním z dějů, které umožňují v buňkách regulovat aktivitu genů. Tento proces je většinou spouštěn přítomností dvoušroubovicové RNA v buňce. Z takovéto RNA mohou být vyštěpovány duplexy malých RNA, většinou o délce 20-25 nukleotidů, za pomoci proteinu zvaného Dicer. Jednovláknové malé RNA uvolněné z těchto duplexů jsou základním kamenem RNA interference a lze je třídit do několika skupin na základě jejich biogeneze. U rostlin se setkáváme s miRNA a siRNA. Malé RNA asociují s proteinem zvaným Argonaut a navádějí jej na základě sekvenční komplementarity k cílové molekule. Argonaut může fungovat buďto sám nebo v komplexu s jinými proteiny. V závislosti na charakteru proteinů účastnících se tohoto děje spouští malé RNA různorodé procesy, které mohou vést ke štěpení mRNA (proces, na který stačí samotný komplex Argonaut a malá RNA), blokování translace nebo modifikacím chromatinu. S RNA interferencí se lze setkat u většiny Eukaryot, kde hraje roli ve vývoji organismů, jejich reakci na stres, úpravách chromatinu a také v obraně proti virům. U rostlin se setkáváme s rozmanitou škálou mechanismů, kterými může RNAi fungovat a kterým začínáme teprve postupně rozumět a doceňovat jejich význam.
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
|
|
Recognition of expressed double-stranded RNAs in mammalian cells
Vaškovičová, Michaela ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Dlhá dvojvláknová RNA je unikátnou štruktúrou, ktorá vzniká počas vírovej replikácie, alebo počas transkripcie repetitívnych sekvencií. Cicavčie bunky si preto vyvinuli niekoľko mechanizmov ako reagovať na dvojvláknovú RNA: interferonovú odpoveď, RNA editáciu, a RNA interferenciu. RNA interferencia je evolučne konzervovanou dráhou, ktorá vedie k sekvenčne-špecifickej degradácii cieľovej mediátorovej RNA. V cicavčích bunkách je však RNA interferencia aktívna iba v myších oocytoch, ktoré exprimujú skrátenú verziu proteínu Dicer, zatiaľ čo v somatických bunkách spúšťa dvojvláknová RNA sekvenčne-nezávislú interferonovú odpoveď. Hlavným cieľom moje diplomovej práce bolo zistiť, akým spôsobom ovplyvňujú proteíny viažuce dvojvláknovú RNA smerovanie dvojvláknovej RNA buď do dráhy RNA interferencie alebo do sekvenčne-nezávislých dráh. Na monitorovanie sekvenčne-špecifických a sekvenčne-nešpecifických efektov dvojvláknovej RNA ko-exprimovanej s proteínmi viažucimi dvojvláknovú RNA sme použili luciferázovú reportérovú esej. Naše výsledky ukazujú, že žiadny z testovaných proteínov nie je schopný stimulovať RNA interferenciu v somatických bunkách. Nadmerná expresia proteínu TRBP2 alebo proteínu PACT prekvapivo potlačuje RNA interferenciu v bunkách produkujúcich skrátenú verziu proteínu Dicer. A čo viac,...
|
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
RNA interference in mouse oocytes and somatic cells
Táborská, Eliška ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; O´Connell, Mary Anne (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
RNA interference (RNAi) je dráha, ve které Dicer štěpí dlouhé dvouvláknové RNA endogenního a exogenního původu na krátké interferující RNA (siRNA). Tyto siRNA jsou předány Argonaut proteinům, které jsou efektory sekvenčně specifického post-transkripčního umlčování RNA. RNAi reguluje protein-kodující geny a retrotranspozony nebo zprostředkuje protivirovou imunitní odpověď. Další dráha malých RNA - dráha RNA associovaných s PIWI proteiny (piRNA dráha) umlčuje retrotranspozony v zárodečné linii. Aktivita kanonické RNAi dráhy je v myších somatických buňkách nevýznamná. Dlouhá varianta Diceru zde produkuje mikroRNA (miRNA) které regulují (protein-kodující) geny. RNAi je naopak vysoce aktivní v oocytech, které produkují zkrácenou oocyt-specifickou isoformu Diceru (DicerO ). DicerO nemá N-koncovou DExD helikázovou doménu a má zvýšenou schopnost štěpit dlouhé dvouvláknové RNA. Delece oocyt-specifického promotoru DicerO vede ke globální deregulaci transkriptomu včetně zvýšené exprese domnělých cílových molekul RNAi a MT retrotranspozonů. V důsledkem je defect meiotického vřeténka a neplodnost samic. Oproti tomu piRNA dráha je pro myší oocyty neesenciální, pravděpodobně kvůli překrývající se funkci s RNAi. Tato doktorská práce má za cíl porozumět biologickému významu savčí endogenní RNAi and prozkoumat...
|
|
|
Modulace sarkosinového metabolismu pomocí RNA interference
Šubrtová, Hana
RNA interference představuje účelný nástroj pro modulaci exprese genů sarkosinového metabolismu, a tím i studium role sarkosinu v nádorových onemocněních prostaty. Diplomová práce „Modulace sarkosinového metabolismu pomocí RNA interference“ shrnuje aktuální poznatky o možné regulaci genové exprese pomocí různých typů nukleových kyselin. Dále se věnuje problematice transferu těchto regulačních činidel do cílových tkání a nakonec popisuje sarkosin včetně jeho zapojení do metabolických cyklů buňky. Hlavním cílem experimentální části této práce bylo stanovení vlivu utlumení genové exprese (knock-down) sarkosin dehydrogenázy (SARDH) na ostatní enzymy zapojené do sarkosinového metabolismu. Tento vliv byl posuzován stanovením genové exprese jednotlivých genů kódujících čtyři hlavní enzymy metabolické dráhy sarkosinu pomocí kvantitativní real-time PCR. Experimenty byly prováděny na třech různých typech prostatických buněčných liniích, a to PNT1A, DU-145 a PC3. Nejvýznamnější rozdíly na úrovni genové exprese byly pozorovány u nádorových buněk DU-145, u kterých byl po aplikaci siRNA cílící na SARDH pozorován signifikantní nárůst genové exprese dimetylglycin dehydrogenázy (DMGHD) a sarkosin oxidázy (PIPOX).
|
host ::
RSS.