|
|
Peptidázy monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Proces trávení krve u monogeneí podtřídy Polyopistocotylea je znám pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. V porovnání s ostatními krevsajícími parazity existuje jen malé množství biochemických a molekulárně biologických studií zabývajících se trávicími enzymy u monogeneí vůbec. Proto jsme se zaměřili na biochemickou a molekulární charakteristiku hydrolytických enzymů (peptidáz) u hematofágních druhů Paradiplozoon bliccae a Eudiplozoon nipponicum. Podařilo se nám prokázat přítomnost cysteinových peptidáz, zejména cathepsinu L, v exkrečně sekrečních produktech a solubilním proteinovém extraktu u P bliccae a E. nipponicum. Detekce proběhla použitím fluorogenních substrátů, specifických inhibitorů a značenou sondou DCG-04. Na gelech / membránách po elektroforéze / blotování byly zaznamenány proužky o velikost 35 kDa u obou zástupců a navíc 24 kDa u E. nipponicum. Vzorky byly rozděleny rovněž pomocí 2D elektroforézy a na gelech byly zaznamenány relevantní spoty o velikosti 35 kDa u P. bliccae a 25 ˗ 35 kDa u E. nipponicum, které byly potvrzeny hmotnostně spektrometrickou analýzou jako cathepsiny L. Pomocí degenerovaných primerů, navržených na základě konzervovaného místa cysteinových peptidáz, byla získána částečná sekvence genu pro cathepsin L E. nipponicum. Metodou 3' RACE PCR byla...
|
|
|
Inhibitory proteolytických enzymů motolic
Šteiger, Vladimír ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Salát, Jiří (oponent)
i Abstrakt Motolice (Trematoda) jsou významnými parazity mnoha orgánových soustav bezobratlých i obratlovců včetně člověka, a proto jsou dlouhodobě předmětem celosvětového výzkumu. Za účelem přežití motolic v hostitelích se u nich vyvinuly nejrůznější adaptace a strategie, z nichž se některé odehrávají také na molekulární úrovni. Motolice produkují velké množství molekul, které jsou zapojeny do nejrůznějších esenciálních fyziologických procesů. Mezi takové molekuly řadíme i inhibitory proteolytických enzymů, které například regulují aktivitu těchto enzymů a modulují imunitní odpověď hostitele. Mnohé z inhibitorů jsou pro své vlastnosti také vhodnými kandidáty využitelnými v boji proti motolicím. Tato bakalářská práce shrnuje dosud známé informace, jak o přirozených inhibitorech produkovaných motolicemi, tak o těch syntetických inhibitorech, které byly uměle připraveny. Klíčová slova: Inhibitor, motolice, peptidáza, serpin, cystatin
|
|
|
Odvrhování glykokalyxu u cerkárií ptačích schistosom
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Štěrba, Ján (oponent)
Trichobilharzia spp. jsou ptačí schistosomy příbuzné lékařsky významným lidským parazitům rodu Schistosoma. Penetrující cerkárie jsou dobře známy jako kauzativní agens cerkáriové dermatitidy u lidí. Cerkárie aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomula. Tomuto procesu předchází odhození ocásku, dochází k vyprázdnění penetračních žláz a rozsáhlým povrchovým změnám. Jednou z těchto změn je ztráta vysoce imunogenního glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. O mechanismu jeho odvrhování je poměrně málo informací. Hypotézy jsou založeny na nepřímých důkazech, které navrhují účast peptidáz nebo (fosfo)lipáz z penetračních žláz. Tato práce popisuje změny v povrchové glykosylaci během transformace cerkárií na schistosomula pomocí fluorescenčně značených lektinů a monoklonálních protilátek proti Lewis X antigenu. Lektiny UEA-I, LTA a PNA byly zvoleny jako markery transformace u T. regenti. Dále se tato práce zabývá odvrhováním glykokalyxu cerkárií. Při indukci in vitro vyprazdňování penetračních žláz a značení obsahu žláz jsme pozorovali silnou vazbu sekretů z cirkum- a postacetabulárních žláz na povrch cerkárií T. szidati a...
|
|
|
Cathepsins L of Diplostomum pseudospathaceum cercariae
Perháčová, Terézia ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Hartmann, David (oponent)
Táto štúdia sa zaoberá cysteínovými peptidázami cerkárií motolice Diplostomum pseudospataceum. Naväzuje na doterajší výskum, ktorý u cerkárií biochemicky a hmotnostnou spektrometriou potvrdil prítomnosť cysteínovej peptidázy o veľkosti približne 24 kDa a postuloval jej histolytickú funkciu pri penetrácií tkanív cerkáriami. Pri pokuse o purifikáciu danej peptidázy a charakterizáciu jej peptidolytickej aktivity bolo zistené, že v homogenáte cerkárií sa nachádza viac rôznych cysteínových peptidáz, líšiacich sa ich pI. Podľa peptidolytickej aktivity a testov jej inhibície ide o cathepsin L- like peptidázy, so širokým spektrom pH v ktorom sú aktívne a optimom aktivity pri slabo kyslom až neutálnom pH. Pomocou degenerovaných primerov vytvorených na základe konzervovaných miest cysteínových peptidázbola získaná čiastočná sekvencia troch génov pre katepsíny L D. pseudospathaceum (DpCL1, 2 a 3). Následne boli získané kompletné sekvencie génov DpCL2 a 3 a čiastočná sekvencia bez 5' konca DpCL1 pomocou RACE PCR. Pre potvrdenie funkcie daných peptidáz bol uskutočnený pokus imunolokalizovať ich. Predpoklad bol, že sa nachádzajú v penetračných žľazách. Preliminárne výsledky naznačujú, že by sa niektoré z katepsínov mohli nachádzať tiež v črevách cerkárií. Pre detailnejšiu biochemickú charakterizáciu a...
|
|
|
Cathepsins B of the bird schistosome, Trichobilharzia regenti
Dolečková, Kateřina ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Grevelding, Christoph (oponent) ; Horn, Martin (oponent)
1. Overview Schistosomes have achieved first position among parasitic helminths, because some of them are the etiological agents of a serious human parasitic disease, schistosomiasis, which affects over 200 million people in tropical and subtropical countries (WHO, 2001). Other schistosomatids, such as the bird flukes of the genus Trichobilharzia, have also implications for human health. Although they can mature only in specific hosts (birds), their invasive larvae - cercariae - are able to penetrate also human skin due to chemical signals similar to those present on bird skin (Haas and van de Roemer 1998). Repeated infections result in an inflammatory reaction of the skin called cercarial dermatitis. Due to the increasing number of outbreaks all around the world, cercarial dermatitis is cons disease (Kolářová 2007idered as re-emerging ; Larsen et al. 2004). Among schistosomes, Trichobilharzia regenti is the only species described so far having a unique migration route within vertebrate hosts: after penetration of the skin, the invasive larvae enter peripheral nerves and continue via the spinal cord and central nervous system to the nasal cavity of birds, causing neuromotor disorders or paralyses of birds and even experimental mammals (Hrádková...
|
|
|
Acid peptidases of schistosomes and haematophagous monogeneans
Dvořáková, Hana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Krev je komplexní směs bohatá na živiny. Není proto divu, že si hematofágii osvojilo mnoho bezobratlých, včetně mnoho parazitických helmintů. Obecně platí, že zpracování hemoglobinu (a i jiných krevních proteinů) je u krevsajících helmintů založené na evolučně konzervované síti cysteinových a aspartických peptidáz (např. katepsiny L, B and D). Nicméně, některé skupiny helmintů byly z tohoto hlediska opomíjeny - velmi málo informací bylo známo o výskytu těchto enzymů u hematofágních monogeneí. Předkládaná práce se proto zaměřila na molekulární a biochemické vlastnosti peptidáz, které se mohou potenciálně podílet na zpracování krve u monogenea Eudiplozoon nipponicum (Heteronchoinea, Diplozoidae), ektoparazita z žaber kapra obecného. V homogenátu a exkrečně/sekrečních produktech E. nipponcum převažovala aktivita cysteinových aspartických endopeptidáz, s aktivitou typu katepsinu L převažující nad aktivitou typu katepsinu B a doplněné o aktivitu typu cathepsinu D (článek 1). Dále jsme zjistili, že dospělec E. nipponicum exprimuje širokou škálu katepsinů L, které mají odlišné strukturální vlastnosti a tím pravděpodobně i odlišné funkce. Vlastnosti a lokalizace dvou vysoce exprimovaných EnCL naznačují jejich roli při trávení proteinů hostitelské krve. Je překvapivé, že pouze jediný katepsin B je...
|
|
|
Inhibitory Kunitzova typu u Eudiplozoon nipponicum
Černíková, Markéta ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Jedličková, Lucie (oponent)
Proteiny obsahující Kunitz domény jsou nejčastěji inhibitory serinových proteáz. Jejich obecnou charakteristikou je přítomnost tří disulfidových vazeb a relativně malá velikost kolem 6-10 kDa, ale nezřídka se objevují velké proteiny s několika Kunitz doménami nebo jsou tyto domény součástí komplexnějších proteinů. Jejich funkce obvykle souvisí s regulací fyziologických a proteolytických procesů, ale i s interakcí s patogeny nebo jinými obrannými mechanismy, např. jako součást hlenu sasanek nebo jedu hadů a jiných bezobratlých živočichů. Zaměřili jsme se na Kunitz proteiny u Eudiplozoon nipponicum, parazita třídy Monogenea ze žaber kapra obecného (Cyprinus carpio). V transkriptomu tohoto parazita bylo identifikováno na základě podobnosti s již popsaným Kunitz proteinem EnKT1 několik dalších podobných sekvencí, z čehož lze usuzovat, že tento parazit využívá pro svou specifickou potravní strategii, podobně jako i jiní krevsající paraziti, celou sadu inhibitorů serinových proteáz s různými konkrétními funkcemi. Pomocí PCR bylo několik sekvencí s Kunitz doménou nalezených v transkriptomu ověřováno a případně doplněno pomocí RACE-PCR. Jeden protein, nazvaný EnKC1, byl následně produkován rekombinantně expresí v buňkách bakterie E. coli kmenů SHuffleTM a Rosetta Gami B. U rekombinantního proteinu s Kunitz...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
host ::
RSS.