|
|
Interakce hlavního kapsidového proteinu polyomavirů s jadernými laminy
Žáčková, Sandra ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Tato práce se soustředí na studium interakcí virových strukturních proteinů myšího polyomaviru (MPyV) a BK viru se strukturou jaderné laminy. Cílem bylo objasnit, zda a případně jakým způsobem virus, potažmo virové strukturní proteiny, interagují s jadernou laminou a jak tyto interakce ovlivňují její vlastnosti. Předpokládali jsme, že exprese virových proteinů bude indukovat rozrušení struktury jaderné laminy, které následně umožní únik virionů z jádra v závěrečné fázi infekce. Strukturní proteiny MPyV byly exprimovány z expresního vektoru pMPyV LATE, který zajistil lokalizaci virového proteinu VP1 podobnou jako u infikovaných buněk - převážně v perinukleárních oblastech jádra. Zároveň v těchto buňkách byly nalezeny defekty v barvení jaderné laminy indikující její narušení tak, jak je tomu v buňkách infikovaných MPyV. Pro experimenty jsme používali ještě expresní vektor pMPyV mut3 VP1 kódující mutovaný protein VP1. Při transientní expresi v buňkách vykazoval mutovaný protein VP1 sice difúzní jadernou lokalizaci, ale pozorovali jsme výrazné deformace a poruchy barvení jaderné laminy, které naznačují významnou roli proteinu VP1 ve změnách vlastností jaderné laminy v infikovaných a transfekovaných buňkách. Zjistili jsme, že největší množství proteinu VP1 v buňkách po transfekci pMPyV LATE a v pozdní...
|
|
|
Vývoj experimentálního systému založeného na Cre/LoxP rekombinaci pro produkci polyomavirových mutant.
Hron, Tomáš ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Myší polyomavirus je významným zástupcem čeledi Polyomaviridae s potenciálním využitím v genové terapii a imunoterapii. Práce s virovými mutantami je důležitou součástí jeho studia, ale současné metody jejich produkce jsou pracné a poskytují nízký výtěžek. Tato práce se zabývá vývojem nového experimentálního sytému, který umožňuje pomocí Cre/loxP rekombinace generovat intaktní polyomavirový genom z rekombinantního plazmidu in vivo. Během rekombinace dochází k nevyhnutelnému vložení jednoho loxP místa do vzniknuvšího virového genomu. Byly připraveny dvě varianty produkčních plazmidů, které vytvářejí virový genom divokého typu s loxP místem vloženým mezi poly(A) signální sekvence časných a pozdních genů, nebo v intronové oblasti časných genů. Inzerce loxP místa mezi poly(A) signální sekvence měla dramatický dopad na expresi virových genů a vedla k úplné ztrátě infektivity viru. Naopak, substituce loxP místa v intronové oblasti časných genů produkci infekčního viru umožnila. Pro zajištění exprese Cre rekombinázy jsem také vytvořil stabilně transfekované buněčné linie, které mohou přípravu viru zjednodušit. Tato práce ukazuje, že nově navržený systém poskytuje uspokojivý výtěžek viru, řeší omezení vyskytující se u běžně používaných metod a může být využit pro produkci málo infekčních virových mutant. Powered by...
|
host ::
RSS.