|
|
Genetically encoded biosensors of cellular tension and their use in cellular biology
Pelantová, Markéta ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent)
1 Abstrakt a klíčová slova Mechanické síly mají velký vliv na celý život buněk. Ovlivňují buněčnou proliferaci, migraci či diferenciaci a chyby v buněčném vnímání mechanických sil se ukazují být jednou z příčin různých chorob jako je např. hluchota, ateroskleróza či rakovina. Mechanismy, kterými buňky mechanické síly vnímají, jsou nicméně ještě velmi málo probádány a chybějí nástroje, kterými by je bylo možné zkoumat. Geneticky kódované tenzní biosenzory využívající pro detekci tenze FRET jsou jednou ze současně používaných metod pro studium přenosu mechanického signálu v buňce. Jedná se o neinvazivní metodu, jejíž pomocí je možné v živých buňkách sledovat změny v mechanickém napětí na různých proteinech. V tomto textu jsou představeny různé typy existujících geneticky kódovaných tenzních biosenzorů využívajících FRET, proces jejich vytváření a objevy díky nim získané. Klíčová slova: mechanická síla, mechanosenzitivita, FRET, tenzní senzor, příprava biosenzoru
|
|
|
Pokročilé fluorescenční techniky ve výzkumu micelárních systémů a jejich interakcí s biopolymery
Holínková, Petra ; Burgert, Ladislav (oponent) ; Táborský, Petr (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Tato disertační práce je věnována studiu pokročilých stacionárních a časově rozlišených fluorescenčních technik určených pro výzkum vlastností micelárních systémů. Vybrané fluorescenční metody byly použity pro charakterizaci kationtových micelárních systémů septonexu a CTAB a následně pro studium jejich interakcí s hyaluronanem. Za pomoci pyrenu jako fluorescenční sondy bylo studováno agregační chování daných tenzidů, z emisního polaritního indexu pyrenu byla určena jejich kritická micelární koncentrace (CMC) a pomocí zhášení fluorescence pyrenu agregační číslo micel. Dále byly studovány změny základního fluorescenčního chování fluoresceinu a prodanu v koncentrační škále septonexu od velmi nízkých koncentrací pod CMC až po několikanásobně vyšší koncentrace než CMC. Velkou kapitolu tvoří studium Försterova přenosu energie mezi perylenem a fluoresceinem v micelárním prostředí daných tenzidů a vliv přídavku hyaluronanu do tohoto systému. Následující kapitola je věnováno stacionárnímu a časově rozlišenému měření anizotropie fluorescence a jeho použití pro studium vlivu postupného přídavku hyaluronanu k micelárnímu roztoku septonexu a CTAB. Poslední kapitola pojednává o fotofyzikálním chování prodanu v různých prostředích (voda, septonex pod i nad CMC, roztok hyaluronanu, micelární roztok septonexu s hyaluronanem), které bylo diskutováno na základě měření časově rozlišených spekter.
|
|
|
Influence of lipid composition and model peptides on lateral organization of lipid layers
Veľas, Lukáš ; Heřman, Petr (vedoucí práce) ; Malínský, Jan (oponent)
Oxidované fosfolipidy (OxPL) sa nachádzajú v živých organizmoch kvôli oxidatívnemu stresu. Napriek tomu, fyziologická funkcia OxPL nie je doposiaľ úplne známa. Prítomnosť OxPL bola preukázaná v množstve zápalových ochorení akým je ateroskleróza či neurodegeneratívnych ochorení akými sú Parkinsonova a Alzheimerova choroba. V tejto práci prezentujeme vplyv dvoch OxPL na laterálnu heterogenitu modelovej lipidovej membrány. Konkrétne sme skúmali vplyv 1-palmitoyl-2-(5'-oxo-valeroyl)-sn-glycero-3-fosfocholínu (POVPC) a 1-palmitoyl-2-glutaryl-sn-glycero-3-fosfocholínu (PGPC) na formáciu nanodomén prítomných v obrích unilamelárnych vezikulách obsahujúcich 1,2-dioleoyl-sn- glycero-3-fosfocholín (DOPC), cholesterol a sfingomyelín. Len niekoľko málo techník je schopných detegovať nanometrové domény nachádzajúce sa v membráne s vysokým rozlíšením. Časovo rozlíšený Försterov rezonančný prenos energie (TR-FRET) v kombinácii s Monte Carlo (MC) simuláciami poskytuje silný nástroj nie len na detekciu laterálnych heterogenít ale aj ich charakterizáciu s rozlíšením 2 nm. V prítomnosti oboch skúmaných OxPL bol pozorovaný výrazný vplyv na veľkosť nanodomén a v prípade PGPC, ktorý obsahuje karboxylovú skupinu bola detegovaná formácia väčších nanodomén v porovnaní s POVPC, ktorý obsahuje aldehydovú skupinu. MC simulácie boli...
|
|
|
Využití simulace jako komplementární metody pro interpretaci experimentálních dat ve výzkumu fluorescence jednotlivých molekul
CARDA, Zdeněk
Jedno-molekulární metody pro zkoumání fluorescence jsou silným nástrojem pro výzkum zejména ve strukturní a molekulární biologii. Tyto metody přinášejí výhody oproti statistickému zpracování dat souboru mnoha molekul, poskytují kvalitativně nové informace o sledovaných vzorcích. Můžeme tak přímo charakterizovat statistické distribuce a jejich kinetiky. Mezi metody, které toto umožňují, patří fluorescenční korelační spektroskopie, FRET a analýza variance záblesků. S pokračujícím výzkumem v této oblasti jsou získávány nové poznatky a metody, pro jejichž interpretaci zatím neexistují analytické vztahy a ne vždy jsou zpočátku známy jejich limity. Zde s výhodou nastupují počítačové simulace, které šetří nejen finanční náklady při definici limit, ale zároveň pomáhají s interpretací výsledků, a na jejichž základě lze následně formulovat nové teoretické modely.
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
| |
|
| |
|
|
Metody měření elektrického napětí na buněčné membráně
DIVOKÝ, Karel
Cílem této práce bylo sestavit přehledný seznam metod, které se zabývají výzkumem napětí na buněčné membráně. Práce by měla pomoci při orientaci v těchto metodách a také k porozumění jejich fyzikálnímu a biologickému principu. První část se zabývá rozborem fyzikálních vlastností membránového potenciálu. V druhé části jsou zpracované nejdůležitější metody, které membránový potenciál měří. Důležité je také porovnání těchto metod z hlediska jejich zaměření, lokálnosti, fyzikální náročnosti nebo zátěže pro zkoumaný objekt.
|
|
|
Single-molecule fluorescence detection in molecular biology
FESSL, Tomáš
SMFD techniques offer genuine detection possibilities which are often inaccessible using ensemble methods. This was demonstrated in three projects investigating translocation activity of CHD4 protein, analysis of MS2 phage capsid assembly and in-cell characterization of DNA structure. In other projects, binding interactions between two fluorescent probes and a short oligonucleotide were characterized and all optical depth of focus extended microscope configuration for imaging of individual molecules inside bacterial cells was developed and tested.
|
|
| |
host ::
RSS.