|
|
Nanotransportéry pro teranostické aplikace
Dostálová, Simona ; Adam,, Vojtěch (oponent) ; Kizek, René (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá využitím bakteriofága jako nanotransportéru léčiv v teranostice. Tímto termínem se označují v posledních letech velmi studované systémy, umožňující spojit diagnostiku, cílenou dopravu léčiv a monitorování odezvy pacienta na podanou léčbu. Tyto systémy jsou velmi vhodné zejména pro léčbu heterogenních onemocnění, jako je rakovina. Současné možnosti léčby jsou totiž často zatěžující pro celý organismus pacienta a snižují tak schopnost jeho boje s touto chorobou. Teoretická část práce je zaměřena na popis možností virových kapsid, proteinů a anorganických sloučenin jako nanotransportérů léčiv. V praktické části jsou srovnány různé metody kultivace bakteriofága v tekutém i tuhém médiu a s různými koncentracemi cukru maltózy, na jehož receptory na hostitelské buňce se bakteriofág váže. Jako optimální byla zvolena kultivace v tuhém médiu s 0,2% maltózou. Praktická část je zaměřena zejména na využití bakteriofága jako nanotransporétru cytostatického léčiva doxorubicinu. Byla sledována enkapsulace léčiva po aplikaci 0; 12,5; 25; 50; 100 a 200 g/ml doxorubicinu s použitím fluorescenční detekce. Bakteriofág byl prokazatelně schopen enkapsulovat všechny aplikované koncentrace doxorubicinu. Byly sledovány různé doby enkapsulace léčiva (2; 4; 8 a 12 hodin), přičemž jako optimální byly zvoleny 2 hodiny, jelikož při delší době nebylo enkapsulováno větší množství léčiva. Na závěr byly porovnány schopnosti enkapsulace léčiva bakteriofága a proteinu apoferritinu. Bakteriofág byl schopen enkapsulovat 4× větší koncentrace doxorubicinu a ten z něj byl uvolňován během promývání 10× méně než v případě apoferritinu. V práci tak bylo potvrzeno, že bakteriofág je vhodnou platformou pro cílené dopravování léčiv v teranostice.
|
|
|
Ověření potenciálu pulzní proteolýzy pro studium konformační stability cytochromů b5
Maroušková, Růžena ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Monooxygenasový systém se smíšenou funkcí hraje velkou roli při metabolismu cizorodých látek. Hlavní součástí tohoto systému je cytochrom P450, díky němuž jsou látky přicházející do našeho těla převáděny na polárnější produkty. Cytochrom b5 (cyt b5) je schopen modulovat funkci cytochromu P450, mechanismus této modulace však dosud nebyl zcela objasněn. Předpokládá se, že by to mohlo být zprostředkováno buď přenosem elektronů z cyt b5, nebo i allosterickou modulací cytochromu P450 vyvolanou interakcí s cyt b5. Cílem práce bylo nalézt a připravit vhodný analog cyt b5, který by nebyl schopen přenosu elektronů, ale přitom by byl strukturně velmi blízký nativnímu cyt b5. V práci byla pro sledování konformační stability cyt b5 a jeho analogů využívána metoda pulzní proteolýzy. Tato metoda využívá štěpení proteinu proteasou v prostředí denaturačního činidla. Pro solubilní proteiny bývá jako denaturant využívána močovina a jako proteasa thermolysin. Pro membránové proteiny se jako denaturant používá spíše SDS a v tomto prostředí se jako proteasa využívá subtilisin. Cílem diplomové práce bylo pomocí této metody porovnat konformační stabilitu nativního lidského cyt b5 obsahujícím v aktivním centru hem s apo-cyt b5 a cyt b5 rekonstituovaným s MnIII protoporfyrinem IX (MnIII PPIX), CrIII protoporfyrinem IX...
|
|
|
Optimalizace amplifikace DNA izolované z bukálních stěrů pro účely sekvenování
ROŠTÍKOVÁ, Kristýna
Tématem mé bakalářské práce byla problematika odběru primárních vzorků DNA z bukální sliznice, určení ideální délky a optimálních podmínek skladování a následná analýza těchto vzorků. V teoretické části jsem se věnovala preanalytické fázi laboratorního vyšetření. Tedy způsobům odběru vzorků a typem materiálu, který se nejčastěji využívá pro izolaci DNA v molekulárně biologické laboratoři. Následně jsem se zaměřila na samotné metody, jenž se využívají pro analýzu DNA. Jednalo se o izolaci DNA, metody amplifikace DNA, elektroforézu nukleových kyselin a sekvenování DNA. V praktické části jsem zpracovala 42 odebraných vzorků. Nejprve jsem ze vzorků izolovala DNA, u které jsem změřila její koncentraci a čistotu. Poté jsem u těchto vzorků provedla elektroforézu a na základě jejích výsledků jsem se rozhodla, které vzorky budu dále zpracovávat pomocí PCR. Následně jsem elektroforézou zjistila, zda u vzorků proběhla amplifikace DNA. Nakonec jsem vybrala vzorky, které jsem odeslala na sekvenování. Cílem mé bakalářské práce mělo být zjištění optimální délky a podmínek skladování vzorků z bukální sliznice pro další zpracování. Také jsem hodnotila, jak tyto parametry ovlivňují kvalitu, čistotu, množství izolované DNA a také průběh PCR. Dle získaných výsledků se jeví jako optimální uchovávání vzorků v laboratorní teplotě a jejich zpracování v nejkratší možné době, nebo uchovávání vzorků v chladničkové teplotě a zpracování v rámci týdnů až tří měsíců.
|
|
|
Příprava mutantního serpinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
EDEROVÁ, Monika
Do P1 místa serpinu Iripin-1 pocházejícího ze slin klíštěte Ixodes ricinus byla pomocí specifických primerů zavedena bodová mutace zaměňující arginin za tryptofan. Protein obsahující tuto mutaci byl exprimován v chemicky kompetentních buňkách Escherichia coli. Následně byl z těchto buněk extrahován a přečištěn pomocí afinitní a rozměrově-vylučovací chromatografie. Aby byl ověřen dopad zavedené bodové mutace, byla otestována schopnost získaného proteinu tvořit kovalentní komplexy s trypsinem.
|
|
|
Zdravotní risk a zisk geneticky modifikované zlaté rýže
KUČEROVÁ, Kateřina
Lidé v rozvojových zemích velmi často trpí výrazným deficitem vitamínu A vlivem nedostatečné a nevyvážené stravy. Tento vitamín je nezbytný mimo jiné pro tvorbu zrakového pigmentu rhodopsinu. Podle Světové zdravotnické organizace každý rok kvůli tomuto deficitu oslepne až půl miliónu dětí. Jeho nedostatek také oslabuje imunitu a tím výrazně zvyšuje riziko úmrtí na různá infekční onemocnění. Nejlepším řešením této deficience by bylo, kdyby byl vitamín obsažen přímo v často jediném pokrmu, ke kterému se tito lidé dostanou - v loupané rýži. Již existuje zvláštní, geneticky modifikovaná rýže, do které byla komplikovanou a rozsáhlou úpravou její DNA vnesená celá metabolická dráha, která zajišťuje produkci betakarotenu v této plodině. V teoretické části své práce se zabývám projektem zlaté rýže a vzniku této geneticky modifikované plodiny metodou nepřímé transgenoze, pomocí bakterie rodu Agrobacterium tumefaciens. Plazmidy této bakterie jsou schopny začleňovat části své genetické informace do cílového organismu. Díky restrikčním enzymům, umíme do plazmidů vkládat námi vybrané geny, které poté zavedeme do konkrétní rostliny. Jsou ale tyto výtvory bezpečné? Názory na tyto plodiny jsou velice rozmanité, ale jedno zajímá všechny: jak bezpečně určit takto genově manipulovanou rostlinu? V laboratoři si tyto pokusy lze nejlépe osvojit na modelovém materiálu. Proto se v experimentální části své bakalářské práce zabývám transgenozí modelové rostliny Nicotiana tabacum pomocí vybraného kmene Agrobacterium tumefaciens. Tyto bakteriální kmeny mi byly poskytnuty ze soukromých sbírek Ústavu molekulární biologie rostlin AV ČR v Českých Budějovicích. Cílem mé práce v laboratoři bylo praktické zvládnutí metodiky přípravy modelové, geneticky modifikované rostliny a následné ověření přítomnosti vnesených genů ve zkoumaných vzorcích modelového organismu. Konkrétně genů pro rezistenci vůči antibiotikům. K tomuto účelu byla použita izolace DNA, PCR amplifikace a elektroforetické testy. Byl ověřen i signální gen používaný při agroinfekci. Dále bylo sledováno, kolik kopií transgenu se při agroinfekci do výzkumného materiálu integrovalo.
|
|
|
Lidská infekční onemocnění a genově manipulované organizmy
KOBLIHOVÁ, Tereza
Tato bakalářská práce se zaměřuje na detekci transgenů v DNA geneticky modifikovaných plodin, a to především na detekci transgenu nptII, a dále na zjištění štěpného poměru (počtu kopií) vnesených transgenů do další generace. Teoretická část této bakalářské práce obsahuje informace o bakteriích, neboť některé druhy jsou příčinou lidských infekčních onemocnění a přitom některé bakterie se využívají v genetickém inženýrství k transformaci rostlin. Onemocnění, které bakterie způsobují, se léčí antibiotiky, což jsou antimikrobní látky používané k zastavení růstu nebo usmrcení těchto mikroorganizmů. Teoretická část zahrnuje především poznatky o antibiotikách a geneticky manipulovaných organizmech (GMO), s nimiž jsou spjaté obavy o použití selekčního genu nptII v konstruktu těchto organizmů. Neboť tento markerový gen kóduje enzym neomycin fosfotransferázu II, který inaktivuje antibiotikum zvané kanamycin. Organizmus obsahující tento gen je tak vůči tomuto antibiotiku rezistentní. Cílem metodické části této práce bylo vypěstování vlastních geneticky modifikovaných rostlin nesoucích uměle vložené geny pro rezistenci vůči kanamycinu (nptII) a signální gen GUS, a následné stanovení přítomnosti genu nptII ve vzorcích z těchto rostlin. Ke stanovení genu nptII v transgenních rostlinách bylo nejdříve zapotřebí namnožení DNA úseku obsahující tento gen, což bylo provedeno pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a poté byla provedena jeho detekce ve vzorku pomocí gelové elektroforézy. Pro detekci přítomnosti genu nptII v rostlinných vzorcích a k potvrzení transformace byl použit také histochemický test. Jako modelový organizmus byl zvolen tabák virginský (Nicotiana tabacum), který byl transformován pomocí Agrobacteria tumefaciens.
|
|
| |
|
|
Analýza a identifikace proteinů při orgánových dysfunkcích pomocí proteomických metod
Tůma, Zdeněk ; Matějovič, Martin (vedoucí práce) ; Lopot, František (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Proteomika se zabývá hromadným studiem proteinů a jejich vlastností, především struktury a funkce. V medicíně bývá využívána pro analýzu fungování tkání a orgánů ve zdraví a nemoci a hledání biomarkerů. Metody zahrnují přípravu vzorku, separační techniky a hmotnostní spektrometrii. Protože neexistuje univerzální metoda pro analýzu libovolného biologického vzorku, proto analytické techniky vyžadují optimalizaci pro konkrétní typ vzorku a požadované výstupy. Cílem práce bylo vytvořit metodické postupy a vyhodnotit proteomické výsledky ve dvou výzkumných rovinách: experimentální a klinické. První část práce obsahuje experimenty využívající proteomiku pro studium změny proteomu plazmy v klinicky relevantním prasečím modelu sepse vyvolané peritonitidou. Proteomické analýzy byly rovněž výchozí metodologickou strategií v experimentech zaměřených na fyziologii ledvin a patofyziologii akutního poškození ledvin v průběhu sepse. Analýzou biopsií ledvin byl sledován časový průběh změn proteomu způsobený sepsí a chirurgickým zásahem. Ve druhé části dizertační práce jsou zahrnuty práce zabývající se biokompatibilitou mimotělních očišťovacích metod. Byla připravena metoda pro analýzu proteinů interagujících s povrchem kapilár hemodialyzátorů a s adsorbenty systému náhrady funkce jater. Analýzou proteinů...
|
|
|
Structural study of the ASK1:thioredoxin complex.
Pšenáková, Katarína
4 ABSTRAKT Mitogénmi aktivované proteínové kinázy (MAPK) sú najdôležitejšou súčasťou bunkového obranného systému proti stresu. Schopnosť a účinnosť bunkových reakcií na rôzne stresové signály závisí na signálnych dráhach, kde signály z MAPK kinázy kinázy (MAP3K) sú prenášané pomocou fosforylácie na nižší stupeň kaskády tvorený MAPK kinázami (MAP2K) a následne rovnakým spôsobom na MAPK, ktoré tvoria najnižší stupeň signalizačnej kaskády. ASK1 kináza (z angl. Apoptosis signal-regulating kinase 1) je členom MAP3K rodiny a jej aktivácia a inhibícia má významnú rolu v regulácii bunkovej odpovedi na stresové podnety. Regulácia ľudskej formy ASK1 kinázy má silný vplyv na patogenézu mnohých ochorení, jej nadmerná aktivácia, alebo porucha kontroly jej funkcie je spojená s radou kardiovaskulárnych chorôb, neurodegeneratívnych porúch, zápalových ochorení, infekčných ochorení, bunkovým starnutím a s vznikom nádorov, astmy a cukrovky. Aktivita ASK1 je regulovaná interakciami s rôznymi proteínmi, pozornosť je ale sústredená najmä na dva fyziologické inhibítory, cicavčí tioredoxín (TRX) a proteín 14-3-3. Explicitný mechanizmus inhibície ASK1 vytváraním väzieb s TRX a 14-3-3 je však nejasný, vzhľadom na neexistujúce štruktúrne dáta týchto interakcií. Táto diplomová práca je súčasťou rozsiahleho výskumu ľudskej ASK1 a...
|
|
|
Proteom nádorové buňky a studium změn po působení protinádorových léčiv
Tylečková, Jiřina
Rakovina představuje velmi heterogenní skupinu onemocnění a výsledky v současnosti dostupné protinádorové léčby jsou vysoce variabilní s nedostatečnými počty vyléčených pacientů. Pro hledání a vývoj nových, selektivních a specifických, nádorových biomarkerů, které mohou být použity ke sledování stavu nemoci a terapie, se používá celá řada proteomických technik. S ohledem na výše zmíněné skutečnosti jsme se v této práci zaměřili na studium proteomu nádorových buněk a jeho změn po působení protinádorových léčiv se specifickým zaměřením na (a) odpověď ke konvenčním léčivům ze skupiny antracyklinů s přihlédnutím k jejich rozdílnému klinickému využití a (b) identifikaci nových terapeutických cílů v nádorových buňkách rezistentních k biologickým preparátům jako jsou inhibitory (b1) cyklin-dependentních kináz a (b2) Aurora kináz. V této studii jsme identifikovali několik klíčových aspektů, které se vztahovaly k účinkům daunorubicinu, doxorubicinu a mitoxantronu. Zaměřili jsme se na časné intervaly po působení léčiv, kdy je minimalizován vliv apoptózy, a nalezli jsme změny proteinů metabolických a celulárních procesů společné pro všechna tři léčiva. Podstatnější bylo pozorování signifikantních změn proteinů účastnících se tvorby metabolických a energetických prekurzorů, které byly specifické pro působení...
|
host ::
RSS.