|
| |
|
|
Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3
Reissová, Helena ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Helena Reissová Školitel: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních proteinů. Jako modelový protein byla použita lidská karbonylreduktasa 3 (CBR3). Rekombinantní CBR3 je využívána v četných metabolických studiích a její struktura je již dobře popsána jak na úrovni sekvence aminokyselin tak i celého prostorového uspořádání. Bylo popsáno i několik jejích substrátů, ale stále ještě není dostatečně popsána a objasněna její fyziologická funkce a role v metabolismu endogenních látek a xenobiotik. Příprava rekombinantního proteinu vycházela z izolace plasmidu nesoucího jeho kódovou sekvenci (vektoru pOTB7), dále následovala polymerasová reakce (PCR) s vhodně navrženými primery obsahujícími restrikční místa pro vybrané endonukleasy. Produkt PCR byl ligován do amplifikačního vektoru (pCR® 2.1-TOPO® ), vektor byl namnožen v transformovaných kompetentních buňkách. Kódová sekvence byla z vektoru vyjmuta pomocí restrikčních endonukleas a následně subklonována do otevřeného expresního vektoru (pET-15b). Správnost...
|
|
|
Inhibiční studie lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Laštovková, Linda ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Linda Laštovková Supervisor: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of thesis: Inhibition study of human membrane-bound carbonyl reductase. Carbonyl reductases are an important group of enzymes that participate in metabolism of both endogenous substances also xenobiotics. Potential anticancer drug oracin is one of such xenobiotics that is metabolised by various carbonyl reductases to two enantiomers of dihydrooracin. The new human microsomal carbonyl reductase also takes part in biotransformation of oracin. This enzyme was recently purified on Department of biochemical sciences (Faculty of Pharmacy in Hradec Králové). The aim of this study was to find some inhibitors of the new enzyme and distinguish it in terms of inhibitors from another microsomal carbonyl reductase 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1. Flavonoids are substances produced by plants, they have a different both positive and also negative effect on human organism. One of such effect is inhibition effect on diverse enzymes. Carbonyl reductases also fall in this group. It has been described inhibitory effect of different flavonoids on carbonyl reductases. Inhibition study of the new human micorosomal carbonylreductase was...
|
|
|
Participation of Selected Carbonyl Reductases in Deactivation of Anticancer Drugs
Odiana, Romana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Szotáková, Barbora (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Redukce je opakem oxidace a může jí být buď ztráta atomu kyslíku, nebo získání dvou atomů vodíku. Redukce karbonylové skupiny xenobiotik byla hlavním tématem této práce. V naší práci jsme se pokusili identifikovat a charakterizovat lidské karbonylreduktázy zodpovědné za deaktivaci protinádorových léčiv. Rakovina je jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích, proto je hledání nových a efektivních způsobů léčby velmi důležité. Inhibice enzymů, které se mohou podílet na rozvoji choroby nebo jejích relapsů a/nebo snížení účinnosti terapie deaktivací léčiv, může být způsobem, jak zlepšit léčbu a snad i snížit dávky léčiv a tím i incidenci nežádoucích účinků cytostatik. V první části našeho projektu jsme se soustředili na rozpustnou cytosolickou reduktázu, AKR1C3. Tento enzym se účastní metabolismu pohlavních hormonů a může hrát důležitou roli v rozvoji rakoviny prsu a prostaty. Testovali jsme její schopnost metabolizovat protinádorová léčiva inkubací s oracinem a doxorubicinem a následným stanovením metabolitů pomocí HPLC. Podařilo se nám prokázat, že AKR1C3 je schopná deaktivovat doxorubicin s Km 355 μM a oracin s Km 110 μM. AKR1C3 tedy může ovlivnit protinádorovou terapii, zejména pokud je její exprese v zasažené tkáni zvýšená. Druhá část projektu byla zeměřena na purifikaci nové lidské...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2
Tobolová, Veronika ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Veronika Tobolová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2 Kódová sekvence AKR1C2 dodaná ve vektoru pOTB7 byla metodou PCR pomnožena a pomocí alkalické lýze přečištěna. Následně zligována s vektorem TOPO 2.1. Kódová sekvence vložená do vektoru TOPO 2.1 byla transformována do kompetentních buněk E. coli a namnožena. Pro kontrolu proběhlé ligace a transformace byla provedena inkubace buněčné kultury s ampicilinem a inkubace kódové sekvence s restrikčními endonukleasami. Poté byly vzorky sekvence v TOPO 2.1 odeslány na sekvenaci. V dalším kroku došlo k natrávení kódové sekvence v TOPO 2.1 a otevření zakoupeného vektoru pET-15b. Poté následovalo několik pokusů o ligaci sekvence s expresním vektorem pET-15b. Kontrola těchto kroků byla provedena pomocí transformace rekombinantní sekvence do buněk Hb 101, inkubace na živné půdě s antibiotikem a restrikce. V závěru byl vektor s kódovou sekvencí vložen do kompetentních buněk BL-21 a provedena exprese. Po rozbití buněk za použití sonikace a natrávení lysozymem jsme mohli pozorovat výsledek pomocí SDS PAGE.
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1
Lundová, Tereza ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Lundová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1 Aldosareduktasa (EC 1.1.1.21) AKR1B1 je jedním ze 13 lidských enzymů z AKR nadrodiny. Všechny lidské AKR jsou cytosolické a NADP(H) dependentní. AKR1B1 hraje důležitou roli v metabolismu endogenních i exogenních látek. Hlavním endogenním substrátem je glukosa. Její redukce na sorbitol je důsledně spojena se sekundárními diabetickými komplikacemi. Z xenobiotik je metabolizován pomocí AKR1B1 daunorubicin, protinádorové léčivo ze skupiny antracyklinů, které je redukováno na daunorubicinol. Tento metabolit je méně aktivní než původní léčivo a je příčinou antracyklinem způsobené kardiotoxicity. V současnosti je mnoho projektů zaměřených na zkoumání AKR1B1 jako cílového enzymu a hledání specifických inhibitorů. Rekombinantní protein byl připraven v E. coli společně s pET-28b(+) expresním vektorem. Nejprve byla izolována z E. coli cDNA pro AKR1B1 v pOTB7. Kódová sekvence AKR1B1 byla namnožena pomocí PCR. PCR byla provedena s Phusion Hot Start II polymerasou a párem forward a reverse primerů, které obsahují restrikční místa pro NdeI a XhoI. Jako vektor byl použit plasmid pET-28b(+)....
|
|
|
Charakterizace lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Zvěřinová, Michaela ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Zvěřinová Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól Ph.D. Název diplomové práce: Charakterizace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Redukční enzymy se podílí na metabolismu celé řady látek ať už tělu vlastních nebo cizích. Do skupiny redukčních enzymů patří také zástupci karbonylreduktasy. Tyto enzymy mohou být buď rozpustné cytosolické nebo vázané do membrány endoplazmatického retikula, mitochondrií či peroxisomů a řadí se do nadrodin SDR, AKR nebo MDR enzymů. Až výzkumy v posledních letech se zaměřují zejména na charakterizaci mikrosomálních karbonylreduktas. Jedinou mikrosomální karbonylreduktasou, která se podílí na metabolismu xenobiotik je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Při výzkumu biotransformace oracinu se ukázalo, že existuje rozdíl mezi jeho metabolismem v lidských jaterních mikrosomech a purifikovanou 11β-HSD1. Vznikla proto domněnka, že se na jeho metabolismu podílí ještě enzym doposud neznámý, který byl purifikován. Karbonylreduktasy mají širokou substrátovou specifitu a mimo jiné se podílí na metabolismu nejsilnějšího karcinogenu tabákového kouře NNK. Působením těchto enzymů se NNK redukuje na NNAL, který může být vyloučen z organismu. Cílem této...
|
|
|
Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Rudolf Andrýs Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Enzymy redukující karbonylové skupiny se účastní metabolismu mnohých endogenních i exogenních látek. Většina dosud popsaných enzymů účastnících se metabolismu xenobiotik je cytosolických, jediným takovým zatím známým mikrosomálním enzymem je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Podílí se také na metabolismu oracinu, prochirálního protinádorového léčiva, které je redukováno na (+) a (-) 11-dihydrooracin (DHO). Na základě rozdílů stereospecifit mezi lidskou mikrosomální frakcí a 11β-HSD1 se předpokládá podíl dalšího mikrosomálního enzymu na biotransformaci oracinu. Cílem této práce je potvrzení přítomnosti a purifikace tohoto nového lidského mikrosomálního enzymu. Lidské jaterní mikrosomy byly solubilizovány a odsoleny. Jako první purifikační krok byla využita Q-sepharosa. Vybraná frakce Q2, získaná touto metodou, byla podrobena druhému purifikačnímu kroku na Phenyl-sepharose. Jedna ze získaných frakcí splňující požadavky byla dále přečištěna gelovou filtrací. Ve všech frakcích získaných během purifikace byla stanovena redukční aktivita vůči...
|
|
|
Zkoumání účinku CTA1R7K-ChrA-DD způsobujícího toleranci na BDC2.5 CD4 buňky vyvolávající diabetes
Kadová, Zuzana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Zuzana Kadová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Zkoumání účinku CTA1R7K-ChrA-DD způsobujícího toleranci na BDC2.5 CD4 buňky vyvolávající diabetes Tento projekt byl zaměřen na studium CTA1R7K-ChrA-DD proteinu, navozujícího toleranci. Bylo zkoumáno, jestli tento protein může inhibovat autoimunitní diabetes a zda-li léčba CTA1R7K-ChrA-DD proteinem může ovlivňovat proliferaci a produkci cytokinů BDC2.5 CD4 buněk. Léčba CTA1R7K-ChrA-DD proteinem byla účinná, když myši byly léčeny vícekrát (ale pouze jednou ze dvou opakovaných pokusů s použitím stejného protokolu), na druhou stranu, když obdržely pouze jednu dávku, léčba byla bez efektu. Po in vitro restimulaci PS3 peptidem by se dalo očekávat, že u myší, které byly léčeny CTA1R7K- ChrA-DD proteinem bude produkce INF gamma a proliferace snížena, ale ve většině případů, jsme dostali opačný výsledek. Výsledky této studie naznačují, že CTA1R7K-ChrA-DD protein by mohl v budoucnu být jednou z možností léčby autoimunitního diabetu.
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3
Dudová, Radka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Dudová Radka Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3 Purifikace vektoru pOTB7 s kódovou sekvencí aldo-ketoreduktasy 1C3 ( AKR1C3 ) v buňkách Escherichia coli byla provedena metodou alkalické lýze. Kódová sekvence byla následně amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí. Správnost výsledku provedeného kroku byla prokázána ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a restrikční analýzou s restrikční endonukleasou PvuII. V druhém kroku byla kódová sekvence ligována do vektoru Topo 2.1, který byl transformován do kompetentních buněk E. coli. Buňky byly namnoženy a vektor Topo 2.1 s vloženou kódovou sekvencí byl získán metodou alkalické lýze. Výsledek byl ověřen porovnáním velikosti vektoru Topo 2.1 bez vloženého insertu a vektoru Topo 2.1 s kódovou sekvencí na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou s restrikční endonukleasou HindIII. Kódová sekvence byla ověřena metodou sekvenace. Dále byla provedena subklonace kódové sekvence z vektoru Topo 2.1 do expresního vektoru pET-15b. Úspěšnost subklonace byla ověřena porovnáním velikosti prázdného pET-15b a vektoru s vloženou sekvencí. V posledním kroku byl vytvořen...
|
host ::
RSS.