|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2
Tobolová, Veronika ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Veronika Tobolová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2 Kódová sekvence AKR1C2 dodaná ve vektoru pOTB7 byla metodou PCR pomnožena a pomocí alkalické lýze přečištěna. Následně zligována s vektorem TOPO 2.1. Kódová sekvence vložená do vektoru TOPO 2.1 byla transformována do kompetentních buněk E. coli a namnožena. Pro kontrolu proběhlé ligace a transformace byla provedena inkubace buněčné kultury s ampicilinem a inkubace kódové sekvence s restrikčními endonukleasami. Poté byly vzorky sekvence v TOPO 2.1 odeslány na sekvenaci. V dalším kroku došlo k natrávení kódové sekvence v TOPO 2.1 a otevření zakoupeného vektoru pET-15b. Poté následovalo několik pokusů o ligaci sekvence s expresním vektorem pET-15b. Kontrola těchto kroků byla provedena pomocí transformace rekombinantní sekvence do buněk Hb 101, inkubace na živné půdě s antibiotikem a restrikce. V závěru byl vektor s kódovou sekvencí vložen do kompetentních buněk BL-21 a provedena exprese. Po rozbití buněk za použití sonikace a natrávení lysozymem jsme mohli pozorovat výsledek pomocí SDS PAGE.
|
|
|
Versatile use of liquid chromatography and mass spectrometry in drug metabolism studies
Suchanová, Bohumila ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Solich, Petr (oponent) ; Lemr, Karel (oponent)
in Czech Lidský organismus byl od nepaměti vystaven škále chemikálií, které se vyskytují v životním prostředí. Chemická revoluce výrazně ovlivnila biologickou evoluci lidí a vedla k vážnému nepředvídatelnému toxickému působení těchto chemických látek. Odpovědí na neustálý chemický stres byl vývoj široké palety různých enzymů, které jsou schopné přeměňovat xenobiotika. Xenobiotika jsou obvykle vysoce lipofilní, a proto nemohou být vyloučeny z těla bez předchozí biotransformace na hydrofilní, ve vodě rozpustné metabolity. Mezi xenobiotika řadíme nejen chemické látky životního prostředí, ale také léčiva, složky potravy a další látky cizí organismu. Biotransformační studie hrají důležitou roli ve výzkumu i ve vývoji léků. Údaje o metabolismu léčiv jsou obvykle vyžadovány předtím, než nová látka projde všemi vývojovými stádii a stane se lékem. Informace o metabolismu jsou často využívány ke zlepšování vlastností budoucích léčiv, umožňují navrhnout účinnější sloučeniny, nebo jsou využívány v rámci toxikologických studií. Se vzrůstajícím počtem nově vyvíjených látek stoupají nároky na rychlé získání spolehlivých informací o metabolismu těchto látek. Spojení kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie naplňuje požadavek na rychlost a spolehlivost analýzy léčiv a jejich metabolitů, který udává...
|
|
|
Studium vlivu inhibitorů cyklin-dependentních kinas na expresi vybraných AKR a CBR enzymů v lidských buněčných liniích.
Kouklíková, Etela ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Wsól, Vladimír (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Etela Kouklíková Školitel: RNDr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Studium vlivu inhibitorů cyklin-dependentních kinas na expresi vybraných AKR a CBR enzymů v lidských buněčných liniích Inhibitory cyklin-dependentních kinas (CDKi) jsou považovány za vhodnou léčbu zejména u pacientů se špatnou prognózou nebo s pokročilým stádiem rakoviny. Bylo zjištěno, že jedním z účinků některých CDKi je vliv na aktivitu enzymů patřících do nadrodiny aldo-keto reduktas (AKR) a dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR). AKR a SDR enzymy patří do skupiny karbonyl redukujících enzymů. Tyto enzymy se podílejí na metabolismu endogenních látek i xenobiotik. Významnou skupinou xenobiotik, které metabolizují, jsou protinádorová léčiva antracykliny, ze kterých se poté stávají méně účinné látky. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda purvalanol A, roscovitin, dinaciclib, AZD5438 a R547 mohou ovlivnit expresi antracyklinreduktas (AKR1A1, AKR1B10, AKR1C3, AKR7A2 a CBR1) v lidských buněčných liniích HepG2 a HL-60. Exprese antracyklinreduktas v buněčných liniích byla detekována na úrovni mRNA pomocí RT-qPCR a na úrovni proteinu pomocí metody Western blotting. Nejvýznamnější změny v expresi na úrovni mRNA byly v...
|
|
|
Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně
Pelcová, Vendula ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.
|
|
|
Analýza významu genetických faktorů pro prognózu a predikci léčby nádorových onemocnění.
Šůsová, Karolína ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Malátková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Karolína Šůsová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Analýza významu genetických faktorů pro prognózu a predikci léčby nádorových onemocnění Kolorektální karcinom (KRK) je jedním z nejčastějších nádorových onemocnění ve světě a v ČR. Existuje mnoho příčin tak vysoké prevalence a mortality. Obecně se dá říct, že úroveň povědomí o rizikových faktorech či primární prevenci je velice nízká. Léčbu KRK ztěžuje inoperabilita nádoru zapříčiněná diagnostikou v pozdním stádiu, což také snižuje dobu přežití. V chemoterapii KRK je zlatým standardem 5 - fluorouracil s leukovorinem. Velký úspěch má v paliativní terapii také cílená léčba, která prodlužuje dobu přežití. Avšak mnoho pacientů na indikovanou adjuvantní nebo paliativní chemoterapii nereaguje optimálně. Příčinou je léková rezistence. Jedním z mnoha faktorů způsobujících lékovou rezistenci je transport cytostatik z buňky ven, za což jsou odpovědny transportní proteiny nádorových buněk, tzv. ABC transportéry. V souvislosti s jinými typy nádoru se podařilo zjistit odlišné hladiny exprese genů ABC transportérů v nádorových tkáních. Cílem této studie je nalézt markery u kolorektálního karcinomu, které by zlepšili prognózu a léčbu...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4
Kosánová, Kateřina ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Kateřina Kosánová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4. AKR1C4 je jedním ze čtyř lidských enzymů podrodiny aldo-ketoreduktas AKR1C. Jde o monomerní cytosolický protein o velikosti 323 aminokyselin exprimovaný v játrech. Hraje významnou roli jak v metabolismu endogenních, tak i exogenních látek. Podílí se na metabolizaci steroidních hormonů a žlučových kyselin a nejrůznějších léčiv jako např. tibolonu nebo naltrexonu. Hraje roli i v aktivaci některých kancerogenních látek, jako jsou PAH. cDNA enzymu byla dodána v buňkách E. coli DH10B, vložená do vektoru pDNR-LIB. Po rozbití buněk a izolaci plasmidu byla kódující sekvence namnožena pomocí PCR. Následně byla díky štěpícím místům pro Nde I a Xho I endonukleasy, které byly součástí primerů pro PCR, zaligována do vektoru pET-28b. Takto připravený rekombinantní plasmid byl transformován pomocí tepelného šoku do buněk E. coli HB101. Po svém namnožení byl ligovaný plasmid transformován do buněk BL21. Upravené buňky BL21 byly využity k expresi proteinu. Pro indukci overexprese byl použit IPTG. Čistý rekombinantní protein AKR1C4 se získal pomocí ÄKTA purifikace na chelatačních...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1
Vomočilová, Iva ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Iva Vomočilová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1 Práce je zaměřena na syntézu lidského proteinu AKR1C1. Kódová sekvence pro tento protein byla objednána v podobě cDNA, která byla vložena do plazmidu pOTB7. Dodané buňky Escherichia coli, nesoucí takto upravený plazmid, byly namnoženy a plazmid byl purifikován pomocí alkalické lýzy. S purifikovaným plazmidem byla provedena polymerasová řetězová reakce s dvojicí navržených primerů, které obsahovaly restrikční místo. S ohledem na potřeby pozdějších reakcí byla zvolena rozpoznávací místa pro restrikční endonukleasy NdeI a XhoI. Pro ověření kvality purifikace plazmidu a úspěšnosti PCR byla použita horizontální elektroforéza. Produkt PCR byl purifikován s využitím elektroforézy na ultra-čisté agaróze. Jako vektor byl zvolen plazmid pET-28b(+). Ten byl namnožen v předem upravených buňkách E. coli HB101 a následně purifikován. Purifikovaný plazmid a purifikovaný produkt PCR byly štěpeny pomocí restrikčních endonukleas XhoI a NdeI. Oba naštěpené úseky byly přečištěny a s využitím T4 DNA ligasy byl fragment PCR vložen do otevřeného vektoru pET-28b(+). Takto upravený plazmid byl...
|
|
|
Klonování a exprese lidské AKR1A1
Kořínková, Petra ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Petra Kořínková Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování a exprese lidské AKR1A1 Aldo-ketoreduktasa 1A1 (AKR1A1) je monomerní cytosolický enzym patřící do skupiny karbonyl redukujících enzymů, nadrodiny aldo-ketoreduktas. Rodina aldo- ketoreduktas se významně podílí na redukčních reakcích endogenních substrátů i první fáze biotransformace xenobiotik. V lidském organismu se nachází 15 zástupců této velké rodiny, které lze nalézt v různých tkáních. Největší zastoupení mají v hepatocytech a renálních buňkách. AKR1A1 katalyzuje reakce aromatických i alifatických aldehydů na jejich odpovídající alkoholy. Z endogenních látek je jeho substrátem mevalonát. Jeho významnými substráty jsou i některá léčiva ze skupiny antracyklinových antibiotik - doxorubicin a daunorubicin. Dále se podílí na biotransformaci sorbitolu a rozvoji diabetických komplikací. Příprava rekombinantního enzymu byla provedena v E. coli za pomoci expresního vektoru pET28b(+). Izolovaná cDNA byla namnožena polymerasovou řetězovou reakcí, katalyzována Phusion Hot Start II polymerasou za přítomnosti specifických primerů, obsahujících restrikční místa pro endonukleasy NdeI a XhoI, kterými byly naštěpeny...
|
|
|
Charakterizace lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Zvěřinová, Michaela ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Zvěřinová Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól Ph.D. Název diplomové práce: Charakterizace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Redukční enzymy se podílí na metabolismu celé řady látek ať už tělu vlastních nebo cizích. Do skupiny redukčních enzymů patří také zástupci karbonylreduktasy. Tyto enzymy mohou být buď rozpustné cytosolické nebo vázané do membrány endoplazmatického retikula, mitochondrií či peroxisomů a řadí se do nadrodin SDR, AKR nebo MDR enzymů. Až výzkumy v posledních letech se zaměřují zejména na charakterizaci mikrosomálních karbonylreduktas. Jedinou mikrosomální karbonylreduktasou, která se podílí na metabolismu xenobiotik je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Při výzkumu biotransformace oracinu se ukázalo, že existuje rozdíl mezi jeho metabolismem v lidských jaterních mikrosomech a purifikovanou 11β-HSD1. Vznikla proto domněnka, že se na jeho metabolismu podílí ještě enzym doposud neznámý, který byl purifikován. Karbonylreduktasy mají širokou substrátovou specifitu a mimo jiné se podílí na metabolismu nejsilnějšího karcinogenu tabákového kouře NNK. Působením těchto enzymů se NNK redukuje na NNAL, který může být vyloučen z organismu. Cílem této...
|
|
|
Participation of Selected Carbonyl Reductases in Deactivation of Anticancer Drugs
Odiana, Romana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Szotáková, Barbora (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Redukce je opakem oxidace a může jí být buď ztráta atomu kyslíku, nebo získání dvou atomů vodíku. Redukce karbonylové skupiny xenobiotik byla hlavním tématem této práce. V naší práci jsme se pokusili identifikovat a charakterizovat lidské karbonylreduktázy zodpovědné za deaktivaci protinádorových léčiv. Rakovina je jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích, proto je hledání nových a efektivních způsobů léčby velmi důležité. Inhibice enzymů, které se mohou podílet na rozvoji choroby nebo jejích relapsů a/nebo snížení účinnosti terapie deaktivací léčiv, může být způsobem, jak zlepšit léčbu a snad i snížit dávky léčiv a tím i incidenci nežádoucích účinků cytostatik. V první části našeho projektu jsme se soustředili na rozpustnou cytosolickou reduktázu, AKR1C3. Tento enzym se účastní metabolismu pohlavních hormonů a může hrát důležitou roli v rozvoji rakoviny prsu a prostaty. Testovali jsme její schopnost metabolizovat protinádorová léčiva inkubací s oracinem a doxorubicinem a následným stanovením metabolitů pomocí HPLC. Podařilo se nám prokázat, že AKR1C3 je schopná deaktivovat doxorubicin s Km 355 μM a oracin s Km 110 μM. AKR1C3 tedy může ovlivnit protinádorovou terapii, zejména pokud je její exprese v zasažené tkáni zvýšená. Druhá část projektu byla zeměřena na purifikaci nové lidské...
|
host ::
RSS.