|
|
Lidská mikrosomální glutathion-S-transferasa
Hrnčiarik, Karel ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Mikrosomální glutathion-S-transferasy (MGST) se účastní druhé fáze biontrasnformace v eukaryotických buňkách a prokaryotických buňkách organismů. Hrají významnou roli v obraně proti kancerogenním, toxickým a farmakologicky aktivním elektrofilním sloučeninám. Mikrosomální glutathion-S-transferasa je membránově vázaný enzym ve formě trimeru, který katalyzuje konjugaci elektrofilních sloučenin s glutathionem a redukci lipidických peroxidů. Peroxidasová aktivita MGST může být důležitá pro ochranu proti lipidické peroxidaci za podmínek oxidačního stresu. Řada biochemických přístupů se užívá pro studování vlastností MGST, tj. enzymové aktivity, nitrobuněčné distribuce, substrátové specifity a bílkovinné struktury. MGST jsou součásti nadrodiny MAPEG (membránově vázané enzymy v metabolismu ikosatetraenových kyselin a glutathionu). Do této nadrodiny patří na základě strukturální a fylogenetické podobnosti enzymy: MGST 1, MGST 2, MGST 3, mikrosomální Ya-GST, prokaryotické MGST tj. MGST bakterie E.Coli a MGST cyanobakterie nazývaná SynMGST (Bressel se sp. 2004) prostaglandin-E-syntasa, aktivující protein 5-lipoxygenasu a leukotrien-C4-syntasu. Enzymy této nadrodiny jsou zapojeny do detoxifikace, ochrany před oxidačním stresem a syntézy prostaglandinu E a cysteinyl-leukotrienu. Na základě pochopení funkcí MGST...
|
|
|
Role reduktas v nádorovém onemocnění.
Škarydová, Lucie ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Souhrn Redukčním enzymům byla dlouhou dobu věnována pouze malá pozornost, ale dnes už je jasné, že jsou významnou součástí endogenního metabolismu a také první fáze biotransformace xenobiotik. Důležitou skupinou redukčních enzymů jsou karbonylreduktasy, které se řadí do dvou nadrodin - dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR) a aldo-ketoreduktasy (AKR). Jejich role v nádorovém onemocnění je dnes intenzivně studována a lze říct, že jejich působení v nádorovém onemocnění lze principiálně rozdělit do dvou oblastí. Bylo zjištěno, že významnou roli hrají karbonylreduktasy v hormon-dependentních nádorových onemocněních prsu, endometria a prostaty. Pro tyto nádory jsou růstovými faktory aktivní estrogeny respektive androgeny, dochází tak ke zvýšenému dělení buňky a tedy i zvýšené možnosti vzniku mutací v důležitých genech, které mohou vyústit v nádorové bujení. Právě karbonylreduktasy se spolu s dalšími enzymy (jako např. aromatasou) podílí na vzniku aktivních pohlavních hormonů, proto může být jejich inhibice důležitým cílem léčby tohoto typu nádorů. Nicméně je nutné určit, které enzymy jsou klíčové pro tvorbu těchto růstových faktorů v jednotlivých typech hormon-dependentních nádorů. Vedle hormon-dependentních nádorů se karbonylreduktasy uplatňují také u nádorových onemocnění, kde hormony jako růstové...
|
|
|
Enzymová aktivita rekombinantních enzymů. Vliv histidinové kotvy.
Navrátil, Václav ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Václav Navrátil Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Enzymová aktivita rekombinantních enzymů. Vliv histidinové kotvy. AKR1B1, AKR1C1 a AKR1C3 jsou tři zástupci z dosud popsaných 15 lidských enzymů nadrodiny AKR. V těle se účastní celé řady biochemických drah a jejich substráty zahrnují jak xenobiotika, tak endogenní látky. Redukce glukosy na sorbitol, katalyzovaná AKR1B1, je spojována s rozvojem sekundárních diabetických komplikací. AKR1B1 se rovněž podílí na kardiotoxickém účinku cytostatika daunorubicinu. AKR1C1 je fyziologicky odpovědná za přeměnu progesteronu na méně účinný 20α-hydroxyprogesteron, čímž reguluje gestagenní aktivitu. Zvýšená exprese AKR1C1 může mít spojitost s rezistencí na některá cytostatika. AKR1C3 u lidí katalyzuje reakce, při kterých vzniká testosteron a 5α-DHT a je rovněž spojována s rozvojem několika druhů rakoviny. Právě významné zapojení těchto enzymů do řady patologických procesů vedlo k jejich bližšímu zkoumání. Cílem této práce bylo posoudit vliv histidinové kotvy a použitého pufru na aktivitu rekombinantních forem těchto enzymů, které jsou běžně používány v biotransformačních studiích léčiv nebo jiných xenobiotik. Nejprve byla pomocí...
|
|
|
Purifikace a charakterizace vybrané lidské mikrosomální reduktasy
Skarka, Adam ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Živná, Lucie (oponent)
Oblast lidských jaterních mikrosomálních reduktas není ještě ani zdaleka prozkoumána. Purifikace a charakterizace dosud nepopsaných enzymů je důležitým krokem k dokončení tohoto úkolu. V mé práci je popsána separace a purifikace těchto reduktas s využitím hydrofobně- interakční chromatografie na nízkotlakém chromatografickém přístroji ÄKTA purifier. Použity byly dvě kolony s různým substrátem, Fenyl sepharosa (low sub) a Oktyl sepharosa. Podmínky separace byly v obou případech nastaveny shodně. Výsledky získané inkubací jednotlivých frakcí a následným měřením na HPLC jednoznačně prokázaly rozdíly mezi oběma kolonami a jejich substráty. Nelze ovšem jednoznačně určit, která kolona je pro purifikaci vhodnější, protože stále zbývá velký prostor pro úpravu a optimalizaci purifikačních podmínek.
|
|
| |
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2
Tobolová, Veronika ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Veronika Tobolová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C2 Kódová sekvence AKR1C2 dodaná ve vektoru pOTB7 byla metodou PCR pomnožena a pomocí alkalické lýze přečištěna. Následně zligována s vektorem TOPO 2.1. Kódová sekvence vložená do vektoru TOPO 2.1 byla transformována do kompetentních buněk E. coli a namnožena. Pro kontrolu proběhlé ligace a transformace byla provedena inkubace buněčné kultury s ampicilinem a inkubace kódové sekvence s restrikčními endonukleasami. Poté byly vzorky sekvence v TOPO 2.1 odeslány na sekvenaci. V dalším kroku došlo k natrávení kódové sekvence v TOPO 2.1 a otevření zakoupeného vektoru pET-15b. Poté následovalo několik pokusů o ligaci sekvence s expresním vektorem pET-15b. Kontrola těchto kroků byla provedena pomocí transformace rekombinantní sekvence do buněk Hb 101, inkubace na živné půdě s antibiotikem a restrikce. V závěru byl vektor s kódovou sekvencí vložen do kompetentních buněk BL-21 a provedena exprese. Po rozbití buněk za použití sonikace a natrávení lysozymem jsme mohli pozorovat výsledek pomocí SDS PAGE.
|
|
|
Versatile use of liquid chromatography and mass spectrometry in drug metabolism studies
Suchanová, Bohumila ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Solich, Petr (oponent) ; Lemr, Karel (oponent)
in Czech Lidský organismus byl od nepaměti vystaven škále chemikálií, které se vyskytují v životním prostředí. Chemická revoluce výrazně ovlivnila biologickou evoluci lidí a vedla k vážnému nepředvídatelnému toxickému působení těchto chemických látek. Odpovědí na neustálý chemický stres byl vývoj široké palety různých enzymů, které jsou schopné přeměňovat xenobiotika. Xenobiotika jsou obvykle vysoce lipofilní, a proto nemohou být vyloučeny z těla bez předchozí biotransformace na hydrofilní, ve vodě rozpustné metabolity. Mezi xenobiotika řadíme nejen chemické látky životního prostředí, ale také léčiva, složky potravy a další látky cizí organismu. Biotransformační studie hrají důležitou roli ve výzkumu i ve vývoji léků. Údaje o metabolismu léčiv jsou obvykle vyžadovány předtím, než nová látka projde všemi vývojovými stádii a stane se lékem. Informace o metabolismu jsou často využívány ke zlepšování vlastností budoucích léčiv, umožňují navrhnout účinnější sloučeniny, nebo jsou využívány v rámci toxikologických studií. Se vzrůstajícím počtem nově vyvíjených látek stoupají nároky na rychlé získání spolehlivých informací o metabolismu těchto látek. Spojení kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie naplňuje požadavek na rychlost a spolehlivost analýzy léčiv a jejich metabolitů, který udává...
|
|
|
Studium vlivu inhibitorů cyklin-dependentních kinas na expresi vybraných AKR a CBR enzymů v lidských buněčných liniích.
Kouklíková, Etela ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Wsól, Vladimír (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Etela Kouklíková Školitel: RNDr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Studium vlivu inhibitorů cyklin-dependentních kinas na expresi vybraných AKR a CBR enzymů v lidských buněčných liniích Inhibitory cyklin-dependentních kinas (CDKi) jsou považovány za vhodnou léčbu zejména u pacientů se špatnou prognózou nebo s pokročilým stádiem rakoviny. Bylo zjištěno, že jedním z účinků některých CDKi je vliv na aktivitu enzymů patřících do nadrodiny aldo-keto reduktas (AKR) a dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR). AKR a SDR enzymy patří do skupiny karbonyl redukujících enzymů. Tyto enzymy se podílejí na metabolismu endogenních látek i xenobiotik. Významnou skupinou xenobiotik, které metabolizují, jsou protinádorová léčiva antracykliny, ze kterých se poté stávají méně účinné látky. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda purvalanol A, roscovitin, dinaciclib, AZD5438 a R547 mohou ovlivnit expresi antracyklinreduktas (AKR1A1, AKR1B10, AKR1C3, AKR7A2 a CBR1) v lidských buněčných liniích HepG2 a HL-60. Exprese antracyklinreduktas v buněčných liniích byla detekována na úrovni mRNA pomocí RT-qPCR a na úrovni proteinu pomocí metody Western blotting. Nejvýznamnější změny v expresi na úrovni mRNA byly v...
|
|
|
Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně
Pelcová, Vendula ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.
|
|
|
Analýza významu genetických faktorů pro prognózu a predikci léčby nádorových onemocnění.
Šůsová, Karolína ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Malátková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Karolína Šůsová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Analýza významu genetických faktorů pro prognózu a predikci léčby nádorových onemocnění Kolorektální karcinom (KRK) je jedním z nejčastějších nádorových onemocnění ve světě a v ČR. Existuje mnoho příčin tak vysoké prevalence a mortality. Obecně se dá říct, že úroveň povědomí o rizikových faktorech či primární prevenci je velice nízká. Léčbu KRK ztěžuje inoperabilita nádoru zapříčiněná diagnostikou v pozdním stádiu, což také snižuje dobu přežití. V chemoterapii KRK je zlatým standardem 5 - fluorouracil s leukovorinem. Velký úspěch má v paliativní terapii také cílená léčba, která prodlužuje dobu přežití. Avšak mnoho pacientů na indikovanou adjuvantní nebo paliativní chemoterapii nereaguje optimálně. Příčinou je léková rezistence. Jedním z mnoha faktorů způsobujících lékovou rezistenci je transport cytostatik z buňky ven, za což jsou odpovědny transportní proteiny nádorových buněk, tzv. ABC transportéry. V souvislosti s jinými typy nádoru se podařilo zjistit odlišné hladiny exprese genů ABC transportérů v nádorových tkáních. Cílem této studie je nalézt markery u kolorektálního karcinomu, které by zlepšili prognózu a léčbu...
|
host ::
RSS.