|
|
Identification of changes in membrane properties of astrocytes in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis
Vaňátko, Ondřej ; Turečková, Jana (vedoucí práce) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Amyotrofická laterální skleróza (ALS) je progresivní neurodegenerativní onemocnění nervové soustavy. Toto onemocnění je charakteristické ztrátou motorických neuronů a odumíráním kosterního svalstva. Astrocyty hrají roli v regulaci nástupu a progresi onemocnění díky jejich asociaci s neurony. Jednou z klíčových funkcí astrocytů je regulace iontové homeostázy. Deregulace tohoto procesu je spojená s řadou neurologických onemocnění. Cílem této práce bylo prozkoumat rozdíly v membránových vlastnostech astrocytů v ALS. Za tímto účelem jsme vygenerovali dvojitě-transgenní myší model s fenotypem podobným průběhu ALS a specifickou expresí zeleného fluorescenčního proteinu v astrocytech. K charakterizaci fenotypu toho modelu jsme použili dva sensorimotorické testy: wire grid hang test a rotarod test. Pomocí imunohistochemických metod jsme dále charakterizovali tento model na buněčné úrovni a prozkoumali expresi konkrétního iontového kanálu. Elektrofyziologické vlastnosti astrocytů jsme charakterizovali pomocí metody terčíkového zámku. Námi vygenerovaný dvojitě-transgenní model má charakteristický ALS fenotyp na úrovni celého organismu a je srovnatelný s původním ALS modelem, nicméně s rozdíly v nástupu a průběhu onemocnění. Tento model má charakteristický ALS fenotyp také na buněčné úrovni, kde dochází ke...
|
|
|
Buněčné mechanizmy regulace kanálu TRPA1
Barvíková, Kristýna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
TRPA1 je teplotně citlivý iontový kanál z ankyrinové podrodiny Tranzientních Receptorových Potenciálových (TRP) receptorů. Tyto proteiny hrají významnou roli v převodu širokého spektra vnějších a vnitřních signálů. Kanál TRPA1, který je hojně exprimován v primárních aferentních neuronech, je významný převodník různých škodlivých a dráždivých podnětů a účastní se také detekce změn teploty. Podobně jako ostatní TRP kanály je TRPA1 tvořen čtyřmi podjednotkami, přičemž každá podjednotka obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6) ohraničených cytoplazmatickým N- a C-koncem. V nativních tkáních je receptor TRPA1 regulován několika fosforylačními místy, která jsou významná z hlediska aktivity TRPA1 za fyziologických a různých patofyziologických podmínek. Za použití mutační metody jsme predikovali a prozkoumali roli potenciálních fosforylačních míst pro proteinkinasu C ve funkci TRPA1, která zvyšuje aktivitu tohoto receptoru. Naše výsledky identifikují rezidua, u kterých fosfomimikující mutace ovlivnila schopnost kanálu reagovat na napěťové a chemické podněty, zatímco mutace za alanin nebo glycin, která znemožňuje fosforylaci na daném místě, funkci kanálu neovlivnila. Identifikovali jsme serin 602 v rámci šestnácté N-koncové ankyrinové repetice, jehož substituce za aspartát překvapivě zcela blokovala...
|
|
|
Buněčné a molekulární mechanizmy aktivace teplotně citlivých TRP iontových kanálů
Máčiková, Lucie ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Anděrová, Miroslava (oponent) ; Jakubík, Jan (oponent)
Tranzientní receptorové potenciálové receptory (TRP) jsou kationtové kanály propustné pro jednomocné i dvojmocné ionty. Speciální skupina označovaná jako termoTRP zahrnuje TRP kanály aktivované přímo změnou teploty. TRPV3, vaniloidní termoTRP kanál typu 3, hojně exprimovaný v keratinocytech, je zapojen do regulace kožní homeostázy, detekce tepla, nocicepce a rozvoje pruritu. Výsledky předložené dizertační práce prokazují důležitou úlohu oblasti cytoplazmatického rozhraní, nacházejícího se mezi podjednotkami, v teplotní aktivaci TRPV3. Vzhledem k výrazné strukturní podobnosti vaniloidních receptorů vyslovujeme hypotézu, že identifikovaná oblast je důležitá pro teplotní citlivost i ostatních vaniloidních termoTRP receptorů (TRPV1, TRPV2 a TRPV4). Podařilo se prokázat, že TRPV3 může být substrátem pro ERK1/2 proteinkinázy (kinázy regulované mimobuněčným signálem 1 a 2) a identifikovat fosforylační místa TRPV3, která jsou cílem ERK1/2. Z nich byl klíčovým fosforylačním místem pro senzitizaci zprostředkovanou ERK kinázou určen threonin 264. Toto místo může mít fyziologický/patofyziologický význam v procesech senzitizace TRPV3 v lidských keratinocytech prostřednictvím MAPK signální kaskády. Tranzientní receptorový potenciálový kanál ankyrinového typu 1 (TRPA1) je polymodální senzor chladu, endogenních...
|
|
|
Mechanisms of Activation and Modulation of Ion Channels Specific for Nociceptive Neurones
Touška, Filip ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Paleček, Jiří (oponent) ; Tureček, Rostislav (oponent)
Lidský organizmus detekuje potencionální škodlivé podněty z okolí pomocí specializovaných volných nervových zakončení v kůži, nociceptorů. Buněčné membrány těchto neuronů jsou vybaveny iontovými kanály, molekulárními senzory, které kódují vnější podněty ve formě akčních potenciálů a vedou je z periferie do vyšších mozkových center. Jedna z významných skupin těchto iontových kanálů je specifická podskupina teplotně citlivých TRP (transient receptor potential) receptorů následovaná iontovými kanály, které generují a vedou akční potenciály: napětově řízenými sodíkovými kanály. Porozumění molekulárním mechanizmům, které se na procesech aktivace těchto iontových kanálů podílejí, je zásadním předpokladem pro nalezení nových terapeutických přístupů pro léčbu bolesti. Charakterizovali jsme vlastnosti sodíkových kanálů podtypu NaV1.9 a NaV1.8 při působení vysokých (nociceptivních) teplot. Ukázali jsme, že aktivita NaV1.9 kanálů zesílená se stoupající teplotou významně přispívá ke vzniku a vedení akčního potenciálu v neuronech zadních kořenů míšních (DRG). Ciguatoxiny (CTX) jsou aktivační toxiny sodíkových kanálů, které způsobují závažné onemocnění ciguatera projevující se poruchami senzorických vjemů. Objasnili jsme mechanizmus CTX-indukované chladové alodynie, což je patologický jev, při kterém dochází ke...
|
|
|
The role of nociceptive synaptic transmission modulation at the spinal cord level in different pain states
Adámek, Pavel ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Vaculín, Šimon (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Bolest je běžným příznakem mnoha klinických syndromů a nemocí. Zejména léčba bolestí neuropatického původu představuje závažný medicínský problém, neboť dostupná analgesie je v řadě případů neúčinná, nebo má výrazné nežádoucí účinky. Vývoj nových analgetických postupů a úspěšná léčba bolesti proto vyžaduje podrobnou znalost mechanizmů vzniku akutních i chronických bolestivých stavů. Proces vzniku, kódování a přenosu signálů o bolestivých podnětech zprostředkovává nociceptivní systém, který je klíčový pro vznik vjemu bolesti v mozku. Modulace nociceptivního synaptického přenosu v zadním rohu míšním představuje důležitý mechanismus ve vývoji a udržování různých patologických stavů bolesti. Tato disertační práce se zaměřila na zkoumání a objasnění některých mechanismů podílejících se na zpracování a modulaci míšního nociceptivního synaptického přenosu u různých modelů bolestivých stavů. Hlavní pozornost byla věnována studiu následujících otázek: (I.) Jakou úlohu mají TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid type 1) kanály, TLR4 (Toll-Like Receptor 4) a PI3K (fosfatidylinositol 3-kináza) v rozvoji neuropatické bolesti po podání chemoterapeutika paclitaxel (PAC) v akutním in vitro a subchronickém in vivo myším modelu PAC-indukované periferní neuropatie (PIPN)? (II.) Do jaké míry je ovlivněna míšní...
|
|
| |
|
|
Functional and structural study of thermally activated TRP ion channels: The role evolutionarily conserved motifs in the TRPA1 modulation
Kádková, Anna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Obšilová, Veronika (oponent)
Ankyrinový receptor TRPA1 je iontový kanál exprimovaný převážně na primárních aferentních senzorických neuronech, kde působí jako polymodální senzor pro bolestivé a dráždivé podněty. Kromě chemických látek (např. isothiokyanáty, skořicový aldehyd a jeho deriváty, akrolein, menthol) může být aktivován chladem, depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany. Iontový kanál TRPA1 je homotetramerem podjednotek, jež jsou topologicky uspořádány do transmembránové oblasti a cytoplazmaticky orientovaných N- a C-konců. Transmembránová oblast je tvořena šesti alfa-helixy propojenými intra- a extracelulárními kličkami. N-konec receptoru se vyznačuje přítomností 16 až 17 ankyrinových repetic (AR), zatímco C-konec je výrazně kratší a má převážně helikální strukturu. Přesná struktura TRPA1 byla částečně rozřešena roku 2015 pomocí kryo-elektronové mikroskopie, avšak funkční úloha jednotlivých oblastí v polymodální aktivaci receptoru není prozatím plně objasněna. Předkládaná disertační práce se zabývá úlohou mezidruhově konzervovaných strukturních a sekvenčních motivů v cytoplazmatických koncích a v S4-S5 oblasti TRPA1 v napěťové a chemické citlivosti receptoru. Pomocí homologního modelování, molekulárně-dynamických simulací, bodové mutageneze a elektrofyziologických technik bylo...
|
|
|
The role of charged residues in the activation and modulation of the TRPA1 ion channel
Zímová, Lucie ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Doležal, Vladimír (oponent) ; Rokyta, Richard (oponent)
Důležitým receptorem pro detekci bolestivých podnětů je iontový kanál TRPA1 exprimovaný na periferních zakončeních nociceptivních neuronů, kde slouží k převodu fyzikálních a chemických signálů z okolí na signalizaci nervové soustavy. Snaha porozumět mechanizmům aktivace TRPA1 na molekulární úrovni je vedená snahou najít vhodné přístupy k léčení chronických bolestivých stavů u člověka. Naše práce se zaměřila na C-koncovou cytoplazmatickou doménu TRPA1 receptoru, kde jsme popsali možné vazebné místo pro vápník, který je nejdůležitějším modulátorem TRPA1. Díky kombinaci homologního modelování a molekulárně dynamických simulací s elektrofyziologickým měřením se nám podařilo navrhnout hypotézu, která vysvětluje molekulární podstatu dědičného bolestivého syndromu způsobeného bodovou mutací TRPA1. K objasnění principu napěťové aktivace tohoto receptoru jsme přispěli popisem aminokyselin na proximálním C-konci a v S4-S5 oblasti transmembránové domény, které se na napěťové aktivaci podílí. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Úloha reaktivních cysteinů v aktivaci lidského TRPA1 iontového kanálu
Synytsya, Viktor ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
TRPA1 je teplotně citlivý iontový kanál patřící do rodiny TRP (transient receptor potential) receptorů. V primárních senzorických neuronech představuje TRPA1 klíčovou molekulu v transdukční dráze bolestivých podnětů, kde se podílí na detekci pálivých, dráždivých a zánětlivých látek endogenního i exogenního původu. Hlavním mechanismem chemické aktivace TRPA1 je kovalentní modifikace cysteinových a lysinových reziduí elektrofilními látkami. Účinnost agonistů je navíc zvýšena napěťovou citlivostí TRPA1, jež se významně uplatňuje při depolarizaci buněčné membrány. Dosud byla prokázána účast několika N-terminálních cysteinů na aktivaci TRPA1, úloha šesti cysteinů v transmembránové oblasti však dosud nebyla systematicky prozkoumána. Předložená diplomová práce se zaměřuje na funkční úlohu transmembránově lokalizovaných cysteinů v aktivaci lidského TRPA1 receptoru. Z výsledků vyplývá, že cysteinová rezidua nereagují přímo s elektrofilními látkami, čtyři z nich se však specificky uplatňují při napěťové aktivaci a vrátkování iontového kanálu, dvě cysteinová rezidua ovlivňují modulaci TRPA1 vápenatými ionty. Druhá část práce je zaměřená na zjištění topologické blízkosti dvou opačně nabitých reziduí, již dříve vytypovaných pro interakci prostřednictvím solných můstků. Současná substituce těchto reziduí za...
|
|
|
Mechanismy přenosu signálu muskarinovými receptory
Dolejší, Eva ; Doležal, Vladimír (vedoucí práce) ; Kršiak, Miloslav (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Muskarinové acetylcholinové receptory (mAChR) patří do rodiny receptorů spřažených s G-proteiny. Existují v pěti podtypech označovaných jako M1 až M5, které se v různém podtypovém zastoupení nacházejí jak v centrálním nervovém systému, tak na periferii. Muskarinové receptory hrají důležitou roli v mnoha specifických fyziologických funkcích. Narušení přenosu přes mAChR se vyskytuje u závažných onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba, schizofrenie či Parkinsonova choroba. Provází je úpadek kognitivních funkcí, který významně souvisí s narušením aktivace M1 receptorů v mozku. Vysoký stupeň homologie ortosterického vazebného místa mAChR velice ztěžuje vývoj podtypově selektivních agonistů. Jedním z mála známých je xanomelin, který účinně aktivuje zejména M1 a M4 podtypy. Xanomelin interaguje s mAChR unikátním způsobem, neboť je kromě reverzibilní vazby do ortosterického místa schopen se na receptor vázat neodmyvatelnou vazbou a alostericky ovlivňovat funkci receptoru. Zatím nevíme, co je podstatou funkční selektivity xanomelinu. Ve snaze o objasnění těchto mechanismů jsme studovali okamžité a dlouhodobé účinky xanomelinu na aktivaci muskarinových receptorů. Použili jsme fibroblasty z vaječníků čínského křečka exprimující jednotlivé podtypy mAChR. Buňky obsahující M2 a M4 receptory jsme přechodně...
|
host ::
RSS.