|
|
Buněčná smrt jako důsledek železem indukovaného buněčného poškození
Běhounek, Matěj ; Balušíková, Kamila (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Železo je esenciální stopový prvek pro většinu známých organismů. Nadbytek železa v buňkách a tkáních však vede k jejich poškozování. Nejčastěji dochází k poškození parenchymatických orgánů, jako jsou játra, pankreas či srdce. Náplní této diplomové práce bylo vytvořit buněčné in vitro modely pro zkoumání vlivu nadbytku železa u hepatocytů a pankreatických beta buněk a na těchto modelech zkoumat děje, které při nadbytku železa vedou k buněčnému poškození. Zaměřili jsme se na zkoumání přítomnosti oxidativního stresu a stresu endoplasmatického retikula a aktivaci apoptotické buněčné smrti. K experimentům jsme používali buňky buněčné linie HEP-G2 zastupující lidské hepatocyty a linie NES2Y zastupující lidské pankreatické beta buňky. Pro studium mechanismů buněčného poškození v důsledku nadbytku železa jsme použili dva přístupy, pomocí nichž jsme sledovali jak akutní, tak dlouhodobý vliv vysokých hladin železa na poškození vybraných buněčných linií. Při studiu akutního vlivu nadbytku železa jsme na buňky aplikovali vysoké dávky železa (za použití 15 mM citrátu železitého v médiu), které vedly k aktivaci buněčné smrti během kultivace buněk v řádu hodin. Dlouhodobý vliv nadbytku železa jsme sledovali u buněk pravidelně kultivovaných v přítomnosti 50 µM a 100 µM citrátu železitého po dobu několika měsíců....
|
|
|
Wnt signaling in intestinal homeostasis and tumorigenesis
Janečková, Lucie ; Kořínek, Vladimír (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Kanonická signální dráha Wnt je jednou z nejdůležitějších drah řídících buněčnou proliferaci a diferenciaci. Je evolučně vysoce konzervovaná a hraje důležitou roli nejen během embryonálního vývoje, ale také v obnově tkání v dospělém organismu. Naopak nefyziologická aktivace této dráhy Wnt způsobuje vznik různých typů lidských onemocnění. Ve střevě je signalizace Wnt úzce spojena s regulací životního cyklu a dělením střevních kmenových buněk a s celkovou obnovou střevního epitelu. Konstitutivní aktivace signální dráhy Wnt vedoucí k rozvoji neoplázie a nádorů stojí za naprostou většinou případů rakoviny tlustého střeva, která je třetím nejčastějším nádorovým onemocněním v rozvinutých částech světa. Cílem této práce bylo odhalit nové aspekty regulačních mechanismů signální kaskády Wnt a také nalézt nové specifické inhibitory této dráhy včetně potvrzení jejich účinku v pokusných myších. Výsledky práce jsou shrnuty ve čtyřech publikacích. První studie se zabývá buněčným zpracováním a posttranslačními modifikacemi myších proteinů Wnt. Tyto procesy jsou nezbytné pro sekreci těchto bílkovin z buňky a jejich následnou signální aktivitu. Další publikace je zaměřená na gen Troy, který jsme popsali jako inhibitor signalizace Wnt. TROY je cílovým genem dráhy Wnt, který byl identifikován chromatinovou...
|
|
|
Polymeric conjugates for deliveryof cytostatic drugs and ABC transporter inhibitors in multi drug resistant tumors.
Sivák, Ladislav ; Kovář, Marek (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Jednou z vážných komplikací chemoterapie nádorů a častou příčinou jejího selhání je schopnost nádorových buněk odolávat účinkům cytotoxických látek. Při ztrátě citlivosti k určitému cytostatiku může být zachována citlivost k jiným léčivům. Velmi časté jsou však případy zkřížené rezistence nádorových buněk, a to i mezi protinádorovými léčivy, které se liší jak strukturou, tak mechanizmem účinku. Tento fenomén byl popsán jako mnohočetná léková rezistence (multidrug resistance, MDR). Existuje mnoho mechanizmů vzniku MDR, ale hlavní příčinu představuje zvýšená exprese ABC transportérů (ATP-binding cassette) a to zejména P-glykoproteinu (P-gp). Tyto ABC transportéry fungují jako ATP dependentní membránové pumpy exportující protinádorové léčiva z buňky a způsobující tak jejich sníženou intracelulární koncentraci. Cílem práce bylo prozkoumat potenciál polymerních léčiv na bázi N-(2- hydroxypropyl)metacrylamidových (HPMA) kopolymerů nesoucích buď cytostatikum, inhibitor ABC transportérů, nebo obojí vázané společně na jeden polymerní nosič pro překonání MDR mediované P-glykoproteinem na doxorubicin (Dox)-rezistentní buněčné linii myší leukemie P388/MDR. Bylo testováno několik nízkomolekulárních inhibitorů P-gp, a to reversin 121 (R121), reversin 205 (R205) a Ritonavir (RIT) a dále jejich derivátů, v...
|
|
|
Charakterizace vlivu senescence na indukci a regulaci smrti nádorových buněk
Nováková, Gita ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
5 Abstrakt Senescence je stav, kdy se bu ka p estane d lit, m ní expresi n kterých gen a je trvale zastavena v ur ité fázi bun ného cyklu. Nenádorové bu ky vystupují z cyklu po ur itém po tu bun ných d lení, nebo jsou-li poškozeny natolik, že jejich další d lení již není žádoucí. U nádorových bun k m že být senescence indukována podprahovým stresem nap . subletálními dávkami chemoterapeutik. Nádorové bu ky tak neumírají, ale z stávají v tkáni a m ní sv j fenotyp na fenotyp charakteristický sekrecí faktor , které tká dále ovliv ují. Stav senescence tedy m že m nit odpov nádorových bun k na lé bu pomocí apoptózu indukujících terapeutik. V této práci jsme se sout edili na analýzu rozdíl v apoptotické signalizaci mezi proliferujícími a senescentními nádorovými bu kami indukované r znými proapoptotickými látkami. Pomocí bromodeoxyuridinu (BrdU) jsme u nádorových pankreatických (PANC-1) a mesoteliálních (H28) bun k indukovali replika ní stres, jehož vlivem se bu ky p estaly d lit a získaly fenotyp senescentních bun k. U t chto bun k jsme pozorovali zvýšenou rezistenci v i apoptóze indukované ligandem TRAILem v kombinaci s homoharringtoninem (HHT) a zvýšenou senzitivitu senescentních bun k v i Fas ligandu, camptothecinu a mVESu. Tyto bu ky take vykazovaly zvýšenou expresi antiapoptotického proteinu c-FLIP a zm ny...
|
|
|
Expression and regulation of the ABC transporters in tumour cells
Tomková, Veronika ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Němcová, Vlasta (oponent)
Estrogénová signalizácia zohráva kľúčovú úlohu v karcinogenéze rakoviny prsníka. Estrogénový receptor (ER) predstavuje prototyp hormónového receptora, ktorý po naviazaní ligandu, estradiolu, translokuje do jadra a zapína cieľové gény súvisiace s bunkovou proliferáciou a prežívaním. Hoci estrogénová signalizácia fyziologicky podporuje vývoj normálneho prsného tkaniva, deregulácie v tejto dráhe prispievajú k rozvinutiu nádorov prsníka, ktoré sú závislé na estrogénovom receptore. Jedným z hlavných problémov v liečbe rakoviny prsníka je vznik získanej rezistencie k bežným protinádorovým liečivám, známej ako mnohonásobná lieková rezistencia (MDR). Prechod od chemoterapie senzitívneho k rezistentnému fenotypu je zvyčajne sprevádzaný zvýšenou expresiou ABC (ATP-binding cassette) transportérov, špeciálnych membránových proteínov zodpovedných za export rôznych bežne používaných protinádorových liečiv z intracelulárneho do extracelulárneho priestoru a je taktiež spájaný s existenciou nádorových kmeňových buniek (CSCs). ABC transportéry nielenže exportujú chemoterapeutiká, ale tak isto modulujú nádorové mikroprostredie prostredníctvom transportu endogénnych intracelulárnych substrátov ako sú leukotriény, sfingolipidy a prostaglandíny. Táto funkcia môže tak isto zohrávať dôležitú úlohu v karcinogenéze. Cieľom...
|
|
|
The role of autophagy in apoptosis induction by fatty acids in pancreatic beta cells.
Žigová, Ivana ; Němcová, Vlasta (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Diabetes mellitus 2. typu predstavuje metabolickú chorobu, ktorá v 21. storočí dosiahla epidemický charakter. K jej vzniku významne prispieva apoptóza pankreatických β buniek indukovaná mastnými kyselinami (MK). Zatiaľ čo nasýtené MK sú pre β bunky silno cytoxické, nenasýtené MK sú β bunkami lepšie tolerovateľné, a dokonca pri spoluinkubácii s nasýtenými MK sú schopné inhibovať ich proapoptotický účinok. Štúdie z poslednej doby naznačujú, že na regulácii apoptózy indukovanej MK sa u pankreatických β buniek podieľa aj autofágia, katabolická dráha uplaňujúca sa pri degradácii a recyklácii bunkových komponent v lyzozómoch. Cieľom tejto diplomovej práce bolo prispieť k objasneniu úlohy autofágie v regulácii apoptózy indukovanej MK. Na modeli ľudských pankreatických β buniek línie NES2Y sme indukovali apoptózu pôsobením 1 mM nasýtenej kyseliny stearovej (SA) a inhibovali účinkom 0,2 mM nenasýtenej kyseliny olejovej (OA) pri ich spoločnej inkubácii. Zistili sme, že nasýtená SA v koncentrácii indukujúcej u β buniek línie NES2Y apoptózu zároveň spôsobuje autofagický blok. Pri spoluinkubácii SA s nenasýtenou OA, v koncentrácii dostatočnej pre inhibíciu proapoptotického účinku SA, je OA tiež schopná inhibovať autofagický blok vyvolaný účinkom SA. Pôsobenie samotnej nenasýtenej OA v takejto koncentrácii nemá...
|
|
|
Mechanismus, regulace a využití TRAILem indukované apoptózy nádorových buněk
Horová, Vladimíra ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Člen proteinové rodiny faktorů příbuzných s TNF - transmembránový ligand TRAIL (tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) - přitahuje pozornost díky své schopnosti specificky a efektivně vyvolávat apoptotickou smrt u různých typů rakovinných buněk. Přesto se často setkáváme se sekundární rezistencí, kterou rakovinné buňky vyvíjejí k působení ligandu TRAIL, přičemž molekulární mechanizmy související s tímto jevem nejsou doposud uspokojivě objasněny. V první publikaci jsme se zaměřili na analýzu role endozomální acidifikace v proximálních signalizačních drahách ligandu TRAIL. Pomocí specifických inhibitorů bafilomycinu A1 (Baf A1) a konkanamycinu A (CCA) jsme u několika vnímavých kolorektálních buněčných linií zablokovali vakuolární ATPázu, která zodpovídá za vnitřní okyselování endocytických váčků a lyzozómů. Zjistili jsme, že citlivost takto ošetřených buněk k cytotoxickému působení ligandu TRAIL je významně a reproducibilně potlačena. Buňky vykazovaly minimální štěpení prokaspázy-8 a výrazně zpomalena (i když pouze dočasně) byla i agregace receptorových komplexů a jejich pohyb po buňce v klatrinem obalených váčcích. Povrchová exprese receptorů TRAIL-R1/DR4 a TRAIL-R2/DR5, jejich internalizace po navázání ligandu TRAIL i aktivace antiapoptotických NF-κB a MAP kinázových...
|
|
|
Stanovení exprese molekul transportu a metabolismu železa u vybraných chronických onemocnění.
Chmelíková, Jitka ; Kovář, Jan (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
9 1 Abstrakt Železo je nezbytné pro lidský organismus vzhledem k jeho účasti jako kofaktoru enzymů v mnoha metabolických drahách. Je součástí hemoglobinu, čili je nepostradatelné pro přenos kyslíku do tkání. Má schopnost existovat ve dvojmocné i trojmocné formě. Dvojmocná forma se však účastní tvorby vysoce reaktivních hydroxylových aniontů, které organismus poškozují. Nehemové železo je přijímáno do cirkulace přes duodenální enterocyt. Vylučování železa se děje pouze deskvamací těchto buněk nebo krvácením. Proto musí být příjem železa přísně regulován. Nadměrný příjem železa je pozorován u některých chronických onemocnění (hereditární hemochromatóza, alkoholové onemocnění jater). Nedostatečný příjem železa může být naopak příčinou sideropenické anemie. Tato diplomová práce má za cíl stanovit expresi molekul transportu železa v duodenu u chronických onemocnění, která vznikají právě narušením regulace příjmu železa. Expresi molekul transportu železa (DMT1, Dcytb, ferroportin, hefestin) jsme stanovili na úrovni mRNA pomocí metody qPCR a na úrovni proteinu pomocí western blotu. Hladina sérového hepcidinu byla stanovena metodou ELISA. Naše výsledky ukazují zvýšení exprese mRNA transportérů DMT1 a ferroportinu, dále ferrireduktázy Dcytb a ferroxidázy hefestinu ve skupině anemiků. U exprese na úrovni proteinů...
|
|
|
Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination
Benada, Jan ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Pro udržení integrity genomu využívají buňky extensivní signální síť nazývanou buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response). DDR je schopná aktivovat kontrolní body buněčného cyklu (checkpoints), které brání dalšímu průchodu buněčným cyklem a umožňují buňce opravit poškozenou DNA. Poruchy těchto ochranných mechanismů se projevují závažnými lidskými onemocněními, především rozvojem rakoviny. Cílem teto práce je přispět k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR a signalizaci kontrolních bodu buněčného cyklu. Zaměřili jsme se zejména na fosfatázu Wip1 (PPM1D), která je hlavním negativním regulátorem DDR a je nezbytná pro zotavení z kontrolních bodu. Nejprve jsme ukázali, že Wip1 je degradovaná během mitózy APC- Cdc20-dependetním mechanismem. Wip1 je dále v průběhu mitózy fosforylována na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice Wip1 umožňuje buňkám adekvátně reagovat i na nízkou hladinu poškození DNA, ke kterému dochází i při nenarušené mitóze. V následující publikaci jsme se zabývali tím, proč mitotické buňky spouštějí pouze časnou DDR a nepokračují k akumulaci opravných faktoru jako je 53BP1. Ukázali jsme, že 53BP1 je fosforylován kinázami CDK1 a Plk1 uvnitř motivu, který je zodpovědný za jeho vazbu na ubiquitin. Tyto...
|
|
| |
host ::
RSS.