|
| |
|
|
Optimalizace přípravy vzorků pro proteomické vyšetření moči v diagnostice onemocnění ledvin
Juránková, Lada ; Přikryl, Petr (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
Tato práce se zabývá optimalizací přípravy vzorků moči před jejich proteomickou analýzou kapalinovou chromatografií s hmotnostně spektrometrickou detekcí. Ačkoliv se proteomická analýza moči provádí řadu let mnoha zavedenými postupy, je často neefektivní z důvodu nízké koncentrace proteinů v moči, kolísání pH a přítomnosti solí, pigmentů a dalších složek moči. Je proto i nadále potřebné vyvíjet nové efektivnější metody přípravy vzorků moči. Hlavním přínosem této práce je optimalizace metody pro efektivní zakoncentrování proteinů ze vzorku moči využívající paramagnetické mikročástice s vázanými karboxylovými skupinami na povrchu a principu HILIC chromatografie. Tento inovativní postup byl porovnán s rutinní metodou využívající centrifugační filtry (FASP) a s metodou izolace proteinů na celulózových magnetických částicích aktivovaných divinylsulfonem. Metodou využívající paramagnetické mikročástice s vázanými karboxylovými skupinami na povrchu se podařilo pomocí LC-MS/MS identifikovat 856 proteinů z pouhého 0,5 mL moče zdravých dárců. Tato metoda poskytovala srovnatelné výsledky jako standardní metoda FASP v několikanásobně kratší době a s nižšími náklady na analýzu.
|
|
|
Monitorování vybraných steroidních hormonů metodou HPLC-MS/MS a studium jejich vlivu na myší spermie in vitro.
Bosáková, Tereza ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
Tato diplomová práce byla zaměřena na vývoj nové metody využívající vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s tandemovou hmotnostní detekcí (HPLC-MS/MS) pro kvantifikaci vybraných steroidních hormonů, a to 17α-ethynylestradiolu (EE2) a progesteronu (PRG), v M2 fertilizačním médiu. Toto médium je používané při kapacitaci spermií in vitro, což je proces, kdy dochází ke komplexním molekulárně-biochemickým změnám ve spermii, na jejichž základě spermie získávají schopnost oplodnění. Fyziologický průběh tohoto procesu je tudíž zásadní pro získání fertilizační schopnosti samčích gamet. Optimalizované HPLC-MS/MS podmínky (kolona Kinetex EVO C18, mobilní fáze 50/50 (v/v) ACN/H2O, s 0,1% obsahem mravenčí kyseliny v obou složkách, průtok mobilní fáze 0,3 ml/min, nástřik 7,5 µl) byly aplikované pro sledování koncentračních změn jednotlivých analytů během časově závislé kapacitace myších spermií. Testované koncentrace pro EE2 byly 200, 20 a 2 µg/l a pro PRG pouze 200 µg/l. Bylo zjištěno, že nejprve dochází k poklesu koncentrace volného, nevázaného EE2 (minimum okolo 60. min kapacitace) a poté k jejímu opětovnému nárůstu. Tento trend vykazovaly všechny testované koncentrace. Koncentrace (200 µg/l) volného, nevázaného PRG klesala po celou dobu kapacitace. Závislosti koncentrace volného, nevázaného hormonu na...
|
|
|
Analytical chemistry unravels the diversity and function of chemicals used for communication and defence in termite societies
Krasulová, Jana ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Lapčík, Oldřich (oponent)
Analytická chemie hraje klíčovou roli při studiu chemické ekologie a jen díky sofistikovaným metodám je možné detekovat biologicky aktivní látky, které se obvykle vyskytují v nepatrných množstvích, často jako složky komplexních směsí. Má práce je zaměřena na aplikaci moderních analytických metod a instrumentace při zjišťování identity, chemické diverzity a funkce semiochemikálií a obranných látek používaných různými druhy termitů. První část mé práce je zaměřena na identifikaci chemických látek používaných při komunikaci, tzn. feromonů. V této části jsem se zabývala studiem chemické komunikace při stopování u tří vybraných termitích druhů. Kromě nejběžnějšího termitího stopovacího feromonu, (3Z,6Z,8E)-dodeka-3,6,8-trien-1-olu, nalezeného u druhu Psammotermes hybostoma (Rhinotermitidae), jsem se podílela na identifikaci dvou nových struktur, (10Z,13Z)-nonadeka- 10,13-dien-2-onu u druhu Glossotermes oculatus (Serritermitidae) a syn-4,6-dimethylundekan-1-olu u druhu Hodotermopsis sjoestedti (Archotermopsidae). Podařilo se nám identifikovat také (3Z,6Z,8E)-dodeka-3,6,8-trien-1-ol jako samičí pohlavní feromon u druhu Psammotermes hybostoma, a syn-4,6-dimethylundekanal jako samčí pohlavní feromon u druhu Hodotermopsis sjoestedti. Identifikovala jsem také chemické složení vícesložkového poplašného...
|
|
|
Stanovení neesterifikovaných mastných kyselin v krevní plasmě
Lacinová, Petra ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Staňková, Barbora (oponent)
Stanovení celkové koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin (nonesterified fatty acids, NEFA) v plazmě patří mezi rutinní biochemické vyšetřovací metody. Pro detailnější metabolické studie je třeba i stanovení jejich profilu, tj. identifikace a kvantifikace jednotlivých složek. Stanovení profilu NEFA se běžně provádí kapilární plynovou chromatografií, není však ujednocen způsob jejich izolace od ostatních plazmatických lipidů. To lze provést buď extrakcí, nebo preparativní tenkovrstevnou chromatografií. Cílem předkládané práce bylo srovnat obě separační techniky. Vzorky směsné krevní plazmy od dobrovolných dárců byly analyzovány kapilární plynovou chromatografií po předchozí separaci tenkovrstevnou chromatografií a alternativně extrakcí kapalina-kapalina. Srovnání výsledků t-testem bylo provedeno jak pro absolutní koncentrace jednotlivých mastných kyselin, stanovené metodou vnitřního standardu (kyselina margarová), tak pro relativní zastoupení (Rel%). Reprodukovatelnost výsledků byla výrazně lepší u extrakční metody než u metody TLC - hodnoty relativní směrodatné odchylky jednotlivých skupin FA podle nenasycenosti byly 4,3- 11,3% vs. 8,6-33,8% pro relativní zastoupení (Rel%) a 16,5-25,5% vs. 15,4-47,4% pro absolutní koncentrace. U jednotlivých FA, které měly zastoupení větší než 0,1 Rel%,...
|
|
|
Stanovení pepsinogenů za použití IgY a IgG
Kulhavá, Lucie ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Snížení koncentrace pepsinogenu A v krevním séru je důležitým markerem rakoviny žaludku, stejně jako nižší poměr pepsinogenu A a pepsinogenu C. V této práci byly porovnány vlastnosti imunoglobulinových frakcí izolovaných z vaječných žloutků po imunizaci slepic pepsinogem, který byl izolován z vepřové žaludeční sliznice, a králičího séra získaného po imunizaci stejným antigenem. Charakteristika a srovnání slepičích a králičích protilátek bylo prováděno za použití metod: ELISA, afinitní chromatografie s imobilizovaným antigenem a hovězím sérovým albuminem, SDS a nativní elektroforézou a MALDI-TOF MS/MS. Specifické králičí protilátky měly značnou afinitu k antigenu a nízkou afinitu k hovězímu sérovému albuminu, a poskytovaly rozdíl mezi pre-imunní IgG a specifickou IgG, což u slepičích protilátek nebylo pozorováno. V případě slepičích protilátek nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi pre-imunní IgY a specifickou IgY proti vepřovému pepsinogenu, a dále byla zjištěna výrazná afinita k hovězímu sérovému albuminu u pre-imunní IgY i u specifické IgY proti vepřovému pepsinogenu. Podobné výsledky byly získány i v experimentech, kdy byl použit lidský pepsinogen A a lidský pepsinogen C. Klíčová slova: Pepsinogeny, ELISA, afinitní chromatografie, protilátky
|
|
|
Vývoj HPLC-DAD-MS/MS metody pro stanovení vybraných toxinů v Muchomůrce zelené.
Musil, Karel ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
(CZ) Tato práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci analytické metodiky, pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem (HPLC-DAD) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem a tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-DAD-MS/MS), pro stanovení amatoxinů (α- a β-amanitinu) a falotoxinů (falacidinu a faloidinu) v hrubém extraktu z kloubouku muchomůrky zelené. S cílem zaručit spolehlivost analytických výsledků byl studován vliv různých parametrů na kvalitu separace a samotné stanovení. Vyvinutá metoda HPLC-DAD dosahuje dobré linearity v rozmezí koncentrací 1 - 100 µg/ml, kdy korelační koeficienty pro obě kalibrační závislosti všech sledovaný látek jsou vyšší než 0,997. Pro stanovované toxiny byly vypočteny limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ), pro α-amanitin 0,90 µg/ml (LOD); 2,99µg/ml (LOQ), β-amanitin 1,07 µg/ml (LOD); 3,56 µg/ml (LOQ), falacidin 2,17 µg/ml (LOD); 7,26 µg/ml (LOQ) a faloidin 0,79 µg/ml (LOD); 2,64 µg/ml (LOQ). Klíčová slova: muchomůrka zelená, -amanitin,-amanitin, falacidin, faloidin, extrakce tuhá látka-kapalina, HPLC-DAD, HPLC-DAD-MS/MS
|
|
|
Peptidové inhibitory imobilizované na magnetické nosiče a Sepharosu aplikované na separaci žaludečních aspartátových proteinas
Rajčanová, Michaela ; Kučerová, Zdenka (vedoucí práce) ; Fusek, Martin (oponent) ; Pacáková, Věra (oponent)
v češtině Lidská žaludeční šťáva obsahuje hlavně aspartátové proteinasy: pepsin A a pepsin C. Oba pepsiny jsou produkovány v žaludeční sliznici jako inaktivní pepsinogeny a k jejich aktivaci na příslušné pepsiny dochází v kyselém prostředí žaludku. Hladiny pepsinogenů v krevním séru odrážejí morfologický a funkční stav žaludeční sliznice. Téma dizertační práce je součástí projektu zabývajícího se zejména vypracováním metody pro separaci žaludečních aspartátových proteinas, která by byla vhodná pro diagnostické účely. Konkrétním předmětem předkládané práce byla příprava nových typů ligandů, která by umožňovala po imobilizaci separaci aspartátových proteinas. Pro studium vazebných vlastností pepsinů byly syntetizovány čtyři heptapeptidy obsahující D-leucinylový zbytek (Val-D-Leu-Pro-Phe-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr- Tyr-Val-D-Leu a Val-D-Leu-Pro-Phe-Tyr-Val-D-Leu). Připravené heptapeptidy imobilizované na agarosové magnetické částice byly použity pro studium jejich interakcí s prasečím pepsinem A a potkaním pepsinem C. Zatímco prasečí pepsin A byl adsorbován na všechny heptapeptidy imobilizované na magnetické částice, potkaní pepsin C se na imobilizované heptapeptidy neadsorboval. Obdobné výsledky byly získány při afinitní chromatografii na heptapeptidech...
|
|
|
Moderní trendy ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii a jejich aplikace
Kozlík, Petr ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Cajthaml, Tomáš (oponent)
(CZ) Dizertační práce se zabývá významnými trendy ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Jedním z těchto trendů je miniaturizace separačních systémů ve spojení s vysokou citlivostí detekce nebo charakterizace a aplikace nových typů stacionárních fází pro separaci polárních látek v systémech vhodných pro hmotnostní detekci, tedy stacionárních fází pro hydrofilní interakční kapalinovou chromatografii (HILIC). Pro stanovení pěti estrogenních polutantů ve vzorcích vod byla vyvinuta miniaturizovaná metoda, tedy metoda kapilární kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (cLC-MS/MS). Bylo testováno několik nových sorpčních materiálů pro extrakci tuhou fází (SPE) s ohledem na výtěžnost extrakce. Nejlepší výtěžnosti (95 - 100 %) bylo dosaženo na kolonce Discovery DSC-18Lt. Optimalizovaná SPE-cLC-MS/MS metoda umožňuje stanovení jednotlivých estrogenů ve vzorcích vody v jednotkách až desítkách ng/l. V HILIC módu byly charakterizovány a porovnány tři stacionární fáze - silikagelová, cyklofruktanová a isopropyl cyklofruktanová. Bylo zjištěno, že na cyklofruktanových stacionárních fázích se uplatňuje vodíková interakce a disperzní síly. U silikagelové fáze jsou tyto interakce méně významné. Ukázalo se, že modifikace silikagelu cyklofruktanem a derivatizovaným cyklofruktanem vede ke...
|
|
|
Enantioseparace vybraných FMOC-derivatizovaných aminokyselin na kolonách Chirobiotic T a Chiralpak QD-AX.
Kašpárková, Marie ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
V této práci byla vyvíjena a následně optimalizována enantioselektivní HPLC metoda s fluorimetrickou detekcí (λEx = 254 nm, λEm = 314 nm) pro chirální separaci čtyř aminokyselin (D/L-alanin, D/L-valin, D/L-leucin, D/L-isoleucin) v derivatizované podobě s důrazem na enantioseparaci D-analogů. Derivatizace aminokyselin byla provedena pomocí 9-fluorenylmethylchloromravenčanu (FMOC-Cl). Retenční a enantioseparační chování studovaných analytů bylo sledováno na chirálních stacionárních fázích založených na bázi teikoplaninu (Chirobiotic T) a chinidinového derivátu (Chiralpak QD-AX). Na koloně Chirobiotic T byly provedeny enantioseparace derivatizovaných aminokyselin za použití polárně-organického separačního módu. Na koloně Chiralpak QD-AX byly provedeny enantioseparace derivatizovaných aminokyselin za použití reverzního a polárně-organického separačního módu. Bylo provedno vzájemné porovnání kolon Chirobiotic T a Chiralpak QD-AX. Jako nejvhodnější se pro separaci FMOC-derivatizované směsi aminokyselin jevila kolona Chiralpak QD-AX v polárně-organickém separačním módu (methanol/acetonitril/octová kyselina/octan amonný 80/18/2/0,1 (v/v/v/w)). Za optimalizovaných podmínek byla provedena kvantifikace FMOC-D- a FMOC-L-enantiomerů jednotlivě i ve směsi. Limity detekce se pohybovaly v rozmezí 15,1 - 31,5 ng/ml...
|
host ::
RSS.