|
|
Regulace pre-mRNA sestřihu v prostředí buněčného jádra
Hnilicová, Jarmila ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Eukaryotní geny obsahují nekódující sekvence - introny, které jsou z pre-mRNA odstraňovány sestřihovými komplexy. Sestřihové komplexy se skládají z pěti RNA-proteinových podjednotek (U1, U2, U4/U6 a U5), které postupně nasedají na pre-mRNA a jsou společně s dalšími bílkovinami nutné pro vystřižení intronu. Mutace v bílkovinách důležitých pro RNA sestřih mohou způsobovat vážná onemocněním, například mutace zvaná AD29 vedoucí k záměně jediné aminokyseliny v proteinu hPrp31 (tato bílkovina je součástí U4/U6 sestřihového komplexu) je příčinou nemoci retinitis pigmentosa, která často končí úplnou slepotou. Ukázali jsme, že hPrp31 AD29 mutant je nestabilní a není řádně začleněný do sestřihových komplexů. Přesto vadný hPrp31 zřejmě má vliv na metabolismus buňky, protože zpomaluje buněčný růst a dělení, což by mohlo vysvětlit, proč tato mutace vede k retinitis pigmentosa. Dále se zaměřujeme na roli buněčného jádra v pre-mRNA sestřihu. Nové U4/U6·U5 snRNP částice jsou přednostně skládány v nemembránových jaderných strukturách - Cajalových tělíscích. Zjistili jsme, že Cajalova tělíska jsou také důležitá pro recyklaci U4/U6·U5 snRNP. Vedle toho jsme se zaměřili na roli chromatinu (především acetylace histonů) při regulaci alternativního sestřihu. Pomocí inhibitorů histonových deacetylázy jsme změnili...
|
|
|
To cap or not to cap? Eukaryotic translation initiation with a special interest in human opportunistic pathogen C. albicans
Feketová, Zuzana ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent)
Candida albicans je bezpochyby veľmi dôležitý oportúnny patogén, ohrozujúci hlavne imunokompromitovaných pacientov. Pokiaľ viem, ide o jediný organizmus, ktorý je schopný prežívať s nemetylovanými čiapočkami nachádzajúcimi sa na 5'konci mRNA. Funkčnou analýzou som potvrdila, že orf19.7626 kóduje translačný iniciačný faktor 4E C. albicans (Ca4E). Predpoklad, že Ca4E proteín by mohol rozpoznávať nemetylované čiapočky, sa nám v modelovom organizme S. cerevisiae nepodarilo potvrdiť. Rod Candida má však aj ďalšiu zvláštnosť- dvojaké dekódovanie CUG kodónu. Vo veľkej väčšine prípadov je dekódovaný ako serín, ale môže ísť aj o leucín, takže vzniká tzv. "štatistický proteóm". Jeden takýto kodón je aj súčasťou mRNA Ca4E proteínu. U C. albicans by sa teda mohli vyskytovať súčasne dve varianty Ca4E - Ca4ELeu a Ca4ESer . Obe formy dokážu nahradiť eIF4E S. cerevisiae, ale spôsobujú termosenzitívny fenotyp, ktorý je výraznejší v prípade Ca4ELeu proteínu. Zmiernenie termosenzitívneho fenotypu sa podarilo docieliť koprodukciou Ca4E spolu s C. albicans eIF4G proteínom (Ca4G). Úlohou eIF4G je prepojiť mRNA s 43S podjednotkou ribozómu pomocou interakcie s eIF4E, ktorá zároveň zvyšuje afinitu eIF4E k čiapočke. Preto sa domnievam, že interakcia Ca4E s eIF4G proteínom S. cerevisiae nie je dostačujúca. Ca4G taktiež...
|
|
|
Role of RecQ helicases in maintenance of genomic stability during mitosis
Černoch, Marek ; Janščák, Pavel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
Helikázy jsou proteiny schopné rozplétání nukleových kyselin, jejich dysfunkce může být nebezpečná pro genomovou stabilitu buňky. Pět helikáz rodiny RecQ identifikovaných v lidských buňkách se podílí na mnoha buněčných pochodech během celého buněčného cyklu včetně mitózy a jsou proto důležité pro jejich správnou funkci. Mutace v helikázách RecQ může způsobit jejich dysfunkci a vážně narušit různé buněčné procesy, například replikaci DNA, kontrolu poškození DNA nebo rozdělení sesterských chromatid. Mutace mohou také vést k nebezpečným syndromům, jejichž typickým příznakem je zvýšené riziko vzniku rakoviny.
|
|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
|
|
Exozóm a jeho role v metabolismu RNA v kvasinkách S. cerevisiae
Holická, Eliška ; Půta, František (vedoucí práce) ; Groušl, Tomáš (oponent)
Exozóm je proteinový komplex přítomný v jádře a cytoplazmě kvasinek podílející se na degradaci, úpravách a nastavení hladiny vzniku a zániku RNA. Jeho jádro se skládá z devíti katalyticky inaktivních podjednotek, se kterými fyzicky asociuje RNA nukleáza Rrp44. Funkce exozómu je závislá na mnoha kofaktorech, respektive fakultativně asociovaných enzymech, což zajišťuje jeho vysokou versatilitu. V různých kompartmentech buňky funguje odlišným způsobem a hraje roli v odlišných procesech. V jádře se podílí především na úpravách prekurzorů různých specializovaných RNA, kdežto v cytoplazmě hlavně na degradaci nativních mRNA. Jeho základní funkcí je ale ve všech těchto procesech exonukleolytické štěpení jednořetězcové RNA od 3' konce. Exozóm má své homology napříč organismy - různé druhy nukleáz v bakteriích, archeální exozóm, PM-Scl komplex (nebo také exozóm) u člověka, což implikuje vysokou konzervovanost této degradační mašinérie. Je tedy zřejmé, že exozóm u kvasinek není jejich evoluční novinkou, spíše naopak některé komponenty tohoto komplexu v průběhu evoluce ztratily svou původní funkci.
|
|
|
Sestřih atypických intronů v S. cerevisiae
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent)
Sestřih pre-mRNA je životně důležitý proces významný pro genovou expresi všech eukaryotických organismů. Pro správný průběh tohoto velmi složitého a dynamického děje je zapotřebí několik specializovaných RNA a velké množství proteinů, které zastávají nejrůznější úlohy nejen přímo uvnitř samotného sestřihového komplexu, ale i mimo něj. Jedním z proteinů účastnících se sestřihu pre-mRNA v kvasince Saccharomyces cerevisiae je i Prp45. Jeho lidským homologem je protein SNW1/SKIP, který se mimo sestřihu podílí i na celé řadě dalších funkcí. U proteinu Prp45 byla zatím spolehlivě popsána pouze účast na druhé transesterifikační reakci sestřihu. Objevily se však i informace naznačující jeho možné zapojení do první transesterifikační reakce. Tato práce přináší další poznatky spojující protein Prp45 s prvním sestřihovou reakcí, které byly získány výzkumem buněk nesoucích mutantní alelu prp45(1-169). Buňky nesoucí tuto alelu vykazují mimo zhoršeného sestřihu i akumulaci některých pre-mRNA. Tato práce se proto zabývala i možným vlivem proteinu Prp45 na export RNA z jádra do cytoplasmy. Nebylo však objeveno žádné spojení mezi transportem RNA a tímto proteinem. Klíčová slova sestřih pre-mRNA; Saccharomyces cerevisiae; Prp45; Mer1; Mud2; Prp22; Rrp6; AMA1; SNW1/SKIP
|
|
|
Úloha cyklofilinů v sestřihu
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Sestřih je proces nezbytný pro správné fungování eukaryotických buněk. Jedná se o velice složitý a dynamický děj, na němž se podílí velké množství proteinů, které plní různorodé funkce buď přímo uvnitř sestřihového komplexu, nebo i mimo něj. Mezi proteiny, které v sestřihu plní důležitou úlohu, patří nepochybně i cyklofiliny. Ty pravděpodobně způsobují konformační změny ostatních komponentů sestřihového komplexu, nebo je udržují v požadovaných konformacích, čímž přispívají k dynamice spliceosomu. Tato práce poskytuje přehled cyklofilinů, u nichž byl potvrzen podíl na sestřihu pre-mRNA, a shrnuje návrhy možných funkcí, jež tyto proteiny mohou v sestřihu zastávat.
|
|
|
Interakce proteinů Prp22 a Prp45 ve spliceosomu pučící kvasinky
Senohrábková, Lenka ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Protein Prp22 je DEAH box RNA helikáza, která má dvě funkce v sestřihu pre-mRNA: účastní se druhé transesterifikační reakce (ATP independentní funkce) a uvolňuje maturovanou mRNA ze spliceosomu (ATP dependentní funkce). Prp45p, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SNW/SKIP, je esenciální sestřihový faktor, přítomný ve spliceosomu po celou dobu sestřihové reakce. Mutanta prp45(1-169) geneticky interaguje s některými alelami NTC komplexu a sestřihovými faktory druhého kroku, včetně PRP22. Jedním z výsledků této práce je zjištění, že mutanty prp22(-158T) a prp22(-327A), které jsou synteticky letální s mutací prp45(1-169), mají kvůli mutaci v upstream regulační oblasti sníženou hladinu proteinu Prp22. Mutanty prp22(-158T), prp22(300PPI) a prp22(-327A) ovlivňují sestřih pre-mRNA s mutací v 5'ss v závislosti na sekvenci druhého exonu. N-terminální mutanty prp22(∆301) a prp22(∆350) jsou synteticky letální s prp45(1-169). Syntetická letalita je možná způsobena snížením efektivity vazby Prp22p do spliceosomů na úroveň, která není pro buňky již viabilní.
|
|
|
DNA vazebné vlastnosti proteinů rodiny CSL ve Schizosaccharomyces pombe
Ptáčková, Martina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Transkripční faktory rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/Lag-1) jsou jako výkonná složka signální kaskády Notch podstatné pro mnohé vývojové procesy metazoálních organismů, ale mohou působit také nezávisle na Notch. V nedávné době byla jejich přítomnost prokázána v houbových organismech, které postrádají signalizaci Notch a také většinu známých metazoálních interakčních partnerů. Proteiny CSL jednobuněčné kvasinky Schizosaccharomyces pombe, Cbf11 a Cbf12, byly experimentálně určeny jako neesenciální jaderné transkripční faktory, které antagonistickým způsobem regulují buněčnou adhezi, produkci extracelulárního materiálu, morfologii kolonií, septaci a oddělování dceřiných buněk, koordinaci jaderného a buněčného dělení a udržování ploidie. Responzivní geny těchto faktorů dosud nejsou známé. V této práci byly predikovány geny S. pombe, jejichž promotorové oblasti představují možné přímé cíle pro vazbu proteinů Cbf. Vazba proteinů Cbf11, Cbf12 a také zkráceniny Cbf12∆N na vazebné elementy pro faktory CSL obsažené v regulačních oblastech vybraných genů S. pombe byla testována in vitro metodou EMSA a následně v případě proteinu Cbf11 in vivo metodou ChIP. Proteiny Cbf11 a Cbf12∆N sekvenčně specificky rozpoznávají vazebné elementy in vitro, ale jejich afinita, stejně tak jako jejich vazebné...
|
|
|
Sestřih intronu TUB3i v buňkách mutantních v genu PRP45
Konířová, Jana ; Půta, František (vedoucí práce) ; Zimmermannová, Olga (oponent)
Protein Prp45 kvasinek Saccharomyces cerevisiae představuje esenciální faktor podílející se na sestřihu pre-mRNA. Již dříve byla v naší laboratoři připravena zkrácená verze genu PRP45, prp45(1-169), vykazující termosensitivní fenotyp. Tato práce se pokouší přispět k lepší charakterizaci této mutanty. Testovali jsem citlivost buněk prp45(1-169) k inhibitoru polymerace mikrotubulů benomylu a následně jsme zjistili, že nadprodukce Tub3 z plasmidu nalezenou citlivost mutant prp45(1-169) k benomylu potlačuje. Dále jsem se zabývali vlivem delece intronů z genů TUB1, TUB3 a COF1 na citlivost buněk prp45(1-169) ke zvýšené teplotě. Pomocí metody RT-qPCR jsme zjistili, že v důsledku mutace prp45(1-169) dochází k výraznému zvýšení hladiny pre-mRNA všech sledovaných genů což by mohlo znamenat, že sestřih v těchto buňkách je poškozen již před první transesterifikační reakcí.
|
host ::
RSS.