|
|
Příprava a testování polyklonálních protilátek proti Cbf11 a Cbf12, transkripčním faktorům rodiny CSL kvasinek Schizosaccharomyces pombe
Tvarůžková, Jarmila ; Půta, František (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ, Suppressor of Hairless, Lag-1) jsou transkripční faktory s klíčovou rolí ve vývoji metazoálních organismů, kdy působí nejen jako součást dráhy Notch, ale i nezávisle na této dráze. Homology proteinů CSL byly identifikovány i v houbových organismech postrádajících signální dráhu Notch. Proteiny Cbf11 a Cbf12 jsou antagonistické paralogy důležité pro koordinaci buněčného a jaderného dělení, regulaci buněčné adhese a integritu chromosomů v jednobuněčné kvasince Schizosaccharomyces pombe. Rovnováha v aktivitě proteinů Cbf11 a Cbf12 je klíčová pro jejich správnou funkci a doposud připravené chromosomálně značené alely těchto proteinů vykazují chování v různé míře odlišné od divokého typu. Dostupnost specifických protilátek by tedy výrazně usnadnila studium biologické funkce proteinů CSL v kvasince S. pombe. V předkládané bakalářské práci je prezentován návrh a příprava imunogenu a testování protilátek proti proteinům CSL získaných z komerčního zdroje. Pomocí bioinformatických nástrojů byly vybrány vhodné imunogenní fragmenty proteinů Cbf11 a Cbf12 a korespondující sekvence DNA byly klonovány do expresního plasmidu. Exprese solubilních proteinů značených hexahistidinem na N-konci byla optimalisována a nativní protein byl purifikován pomocí afinitní (chelatační)...
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Volatilizace anorganických chloridů haloperoxidasami půdních mikroorganismů a rostlin
Loukotová, Šárka ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Biogeochemický cyklus chloru, zvláště utváření organicky vázaného chloru (Clorg) je znám pouze okrajově. V pevninském ekosystému chloridy hrají roli jako stresový faktor a také jako zdroj chloru; jeho původ je ze srážek, které pocházejí z oblačnosti tvořené nad mořem. Clorg jsou přírodně tvořeny biotickou a abiotickou cestou. Biologickými faktory jsou mikroorganismy, půdní enzymy a dokonce i živočichové. Halogenační procesy také probíhají v mořských oblastech, kde hlavním rozdílem je přítomnost bromu vedle chloru, tudíž zde dochází k utváření bromovaných sloučenin. Jednu skupinu Clorg představují těkavé chlorované uhlovodíky (VOCl). Některé VOCl mohou reagovat s atmosférickým ozonem s následkem rozkladu ozonové vrstvy. Nejznámějším zdrojem VOCl je půda, zde žijící mikroorganismy a jejich exoenzymy, které do ní vylučují. Hemové peroxidasy EC 1.11.1.X mohou zprostředkovávat halogenaci organických sloučenin. Peroxid vodíku nebo organické peroxidy jsou substráty pro tyto reakce, kterými je produkována oxokyselina chloru. Poté halogen v reaktivní formě přenáší chlor do organické sloučeniny. Pro studium enzymatického zprostředkování chloračních procesů jsme vybrali komerčně dostupné enzymy (chloroperoxidasa z Caldariomyces fumago a křenová peroxidasa). Ke prekoncetraci tvořících se analytů jsem použila metodu...
|
|
|
Přenos nabitých a nenabitých částic přes modelové biologické membrány
Parisová, Martina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na přípravu modelových stabilizovaných fosfolipidových membrán utvářených na porézním polykarbonátovém nosiči. Pro jejich utváření v pórech hydrofilního polykarbonátového nosiče byl použit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfocholin. Pro charakterizaci formování fosfolipidových vrstev, jejich změn a studium transportních procesů byla využita elektrochemická impedanční spektroskopie a voltametrie. Transport kademnatých a měďnatých iontů byl studován v přítomnosti ionoforu calcimycinu a při jeho absenci, který byl inkorporován do vytvořené fosfolipidové membrány. Protože jsou uvedené ionty často vázány v komplexech s různými látkami, jako jsou nízkomolekulární organické kyseliny (low molecular weight organic acids, LMWOAs), byla tato práce zaměřena také na přenos měďnatých a kademnatých iontů přes modelové fosfolipidové membrány v přítomnosti kyseliny jablečné, citronové a šťavelové při různém pH. Kromě použitého ionoforu byly provedeny pilotní experimenty přenosu měďnatých iontů za pomoci dvou peptidů, nisinu a transportanu 10. Utváření membrány a transportní procesy byly charakterizovány pomocí dvou navržených náhradních elektrických obvodů, které odpovídají situaci pokrytého a nepokrytého polykarbonátového nosiče. Klíčová slova: Fosfolipidy, Membrány, Ionofor, Peptid,...
|
|
|
Příprava vektorů pro heterologní expresi lidského cytochromu P450 1B1
Sojka, Pavel ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Laboratoř molekulární karcinogeneze a vývoje léčiv, pod jejíž záštitou byl tento projekt vypracován, se problematikou cytochromů P450 zabývá již delší dobu. Tyto enzymy se podílejí v drtivé většině na první fázi biotransformace jak xenobiotik, tak endogenních látek, méně často pak na syntéze např. látek steroidní povahy. Práce se zabývá přípravou expresních vektorů založených na plasmidu pET-22b, vhodných pro přípravu lidské formy cytochromu P450 1B1 metodou heterologní exprese. Tento cytochrom P450 je přítomný v endoplasmatickém retikulu především extrahepatálních tkáních a jeho exprese je navíc indukována dioxiny a polycyklickými aromatickými uhlovodíky. K přípravě vektoru byl použit gen pro lidský cytochrom P450 1B1, který byl pomocí metody PCR upraven. Na oba konce genu byla přidána štěpící místa pro restrikční endonukleasy a v jednom případě také úsek kódující histidinovou kotvu pro snadnější izolaci enzymu. Pomocí agarosové elektroforesy byl jak insert, tak štěpený plasmid verifikován a zároveň také purifikován k ligaci a následné transformaci konstruktu do kompetentních buněk E. coli DH5. Klíčová slova: cytochrom P450 1B1, karcinogeneze, plasmid, heterologní exprese
|
|
|
Interakce proteinů s bromfenolovou modří, možnosti analytického využití
Vodičková, Kateřina ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Jednou z metod stanovení proteinů je spektrofotometrická metoda, založená na proteinové chybě acidobazického indikátoru. Často pro tento účel je používaným barvivem bromfenolová modř, jako standard se obvykle využívá hovězí sérový albumin. Tato bakalářská práce zkoumá vliv močoviny na absorpční spektrum komplexu tohoto proteinu s bromfenolovou modří. Rozdíly v absorbanci, způsobené přídavkem močoviny odpovídající fyziologickým hodnotám v moči (0,2-0,4 mol/l), nepřesáhly 1 % (což odpovídá experimentální chybě). Obdobně je tomu až do koncentrace 4 mol/l. Naopak přídavek močoviny v koncentraci 6 mol/l způsobuje pokles absorbance o téměř 29 %, pravděpodobně v důsledku denaturace albuminu.
|
|
|
Mechanismus vzniku nádorových procesů a jejich ovlivnění ellipticinem
Parisová, Martina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) představuje silné protinádorové agens, vykazující vícenásobný mechanismus působení. V této bakalářské práci jsou popsány příčiny vzniku nádorových procesů a informují o mechanismech hlavních farmakologických a cytotoxických účinků ellipticinu spolu s výsledky naší laboratoře ukazující nový mechanismus působení ellipticinu. Cytotoxické a mutagenní působení ellipticinu je přisuzováno především jeho dvěma mechanismům, interkalaci ellipticinu do dvoušroubovicové struktury DNA a jeho působení jako inhibitoru topoisomerasy II. Ellipticin take vytváří kovalentní adukty s DNA, po jeho oxidaci cytochromy P450 a peroxidasami. Cytochromy P450 oxidují ellipticin na pět různých metabolitů, z nichž 13-hydroxyellipticin, 12-hydroxyellipticin a N(2)-oxid ellipticinu vedou ke vzniku dvou majoritních aduktů s DNA. V případě peroxidas je ellipticin oxidován na radikál, poskytující dimer ellipticinu a také na N(2)-oxid ellipticinu. Z důvodu vysoké účinnosti ellipticinu a jeho derivátů proti různým typům nádorových onemocnění stoupá zájem o toto protinádorové léčivo a jsou stále zkoumány nové směry vývoje a přípravy cíleně směřovaných léčiv na bázi ellipticinu.
|
|
|
Studium mechanismu účinku protinádorového léčiva ellipticinu a jeho metabolismu
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem protinádorových léčiv a to především jejich mechanismem účinku, vedlejšími účinky, rezistencí a farmakokinetikou. Jako modelové cytostatikum byl pro tuto práci vybrán protinádorový alkaloid ellipticin. Bakalářská práce popisuje metabolismus této látky v organismu a jeho indukční potenciál na enzymy biotransformující léčiva. Protinádorový alkaloid ellipticin představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami v cílových tkáních. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 na několik metabolitů (7-hydroxyellipticin, 9-hydroxyellipticin, 12-hydroxyellipticin, 13-hydroxyellipticin a N2 - oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7-hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13-hydroxyellipticin a N2 - oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které vytvářejí dva hlavní deoxyguanosinové adukty v DNA. Tyto adukty byly nalezeny jak in vitro v leukemických buňkách (HL-60), v buněčných liniích lidského prsního adenokarcinomu (MCF-7), v neuroblastomových buňkách (IMR-32, UKF- NB-3 a UKF-NB-4) a v buňkách glioblastomu (U87MG), tak i in vivo v prsním karcinomu...
|
|
|
Studium mechanismu účinku protinádorového léčiva tamoxifenu a jeho vedlejších toxických účinků
Kylarová, Salome ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Antiestrogenní (hormonální) terapie je užívána při léčbě nádoru prsu s pozitivním nálezem hormonálních receptorů pro estrogen. Vznik tohoto typu rakoviny je důsledkem dlouhodobé hormonální expozice v průběhu života. Tamoxifen patří mezi nejdůležitější zástupce hormonálních léčiv, které blokují účinky těchto hormonů v prsní nádorové tkáni prostřednictvím kompetitivní vazby na odpovídající receptory. Afinita tamoxifenu k těmto receptorům není dostatečná, avšak v organismu dochází k jeho aktivaci na metabolity, které vykazují afinitu o poznání větší, jmenovitě 4-hydroxytamoxifen a endoxifen. Tvorbu těchto meziproduktů katalyzují enzymy ze skupiny cytochromů P450. Ve druhé fázi jeho biotransformace dochází především k sulfataci těchto produktů katalyzovanou sulfotransferasami a jeho eliminaci z organismu. Vedle těchto aktivních meziproduktů, které svými účinky potlačují další růst nádoru, existují i produkty metabolismu tamoxifenu působící negativně v jiných tkáních organismu. Jedná se především o α-hydroxytamoxifen, který po další aktivaci generuje kovalentní adukty s DNA v jaterní tkáni potkanů a endometriu ženské dělohy. Léčba tamoxifenem je doprovázena četnými vedlejšími účinky, z nichž největší pozornost je věnována možnému vývoji rakoviny endometria či rezistenci nádoru vůči léčbě. Účinky terapie...
|
|
| |
host ::
RSS.