|
|
Fluidizace membrány alkoholy inhibuje signalizaci DesK-DesR u Bacillus subtilis
Vaňousová, Kateřina ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Po chladovém šoku zavádí desaturáza Des u Bacillus subtilis dvojné vazby do řetězců mastných kyselin, které jsou součástí membránových fosfolipidů. Syntéza Des je regulována dvoukomponentovým systémem DesK/DesR. DesK slouží jako senzor stavu membrány a spouští syntézu Des po poklesu fluidity membrány. Cílem této práce je zkoumat biofyzikální změny v membráně, které jsou schopny ovlivnit signalizaci DesK. S využitím lineárních alkoholů (etanolu, propanolu, butanolu, hexanolu, oktanolu) a benzyl alkoholu bylo možné potlačit syntézu Des po náhlém snížení teploty. Změny biofyzikálnch vlastností membrány způsobené přídavkem alkoholu byly sledovány pomocí membránových fluorescentních sond a diferenciální skenovací kalorimetrie. Bylo zjištěno, že fluidizace membrány vyvolaná alkoholy byla doprovázena zvýšenou hydratací na rozhraní mezi lipidy a polárním vnějším prostředím. To je spojeno s poklesem aktivity DesK. Přídavek alkoholů napodobuje nárůst teploty, který může být měřen izotermálně pomocí anizotropie fluorescence. Účinek alkoholů na periferii membrány je v souladu s konceptem mechanizmu, kdy dva hydrofilní motivy umístěné na opačných koncích transmembránové oblasti DesK, které fungují jako molekulární měřítko, vnímají teplotně závislé změny membránových vlastností.
|
|
|
Charakterizace ABC-F proteinu Sco0636 u Streptomyces coelicolor
Pinďáková, Nikola ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Hlavním tématem této diplomové práce jsou ARE (rezistenční) proteiny z ABC-F rodiny druhé třídy ABC proteinů. ARE proteiny udílí rezistenci k antibiotikům, které se váží na velkou ribozomální podjednotku a inhibují tak proteosyntézu. Jedním z ARE proteinů je protein Lmr(C), který je součástí klastru pro biosyntézu linkomycinu u Streptomyces lincolnensis a dle nových výsledků se zdá, že Lmr(C) nemusí být striktně rezistenčním proteinem, ale může mít regulační funkci. Rozhodli jsme se pro studium Sco0636 nejbližšího homologu Lmr(C) u Streptomyces coelicolor, která je modelovým organismem při studiu sekundárního metabolismu. Díky produkci barevných pigmentů, lze sledovat vliv ARE proteinů na sekundární metabolismus přímo na plotnách. Připravila jsem deleční mutantu a kmen s konstitutivní expresí sco0636 a sledovala jsem vliv na fenotyp. Sledovala jsem produkce modrého aktinorodinu a stanovila jsem minimální inhibiční koncentrace k vybraným antibiotikům, které působí na úrovni ribozomu. Zjistila jsem, že Sco0636 udílí vysokou rezistenci k tiamulinu, a byl tak pojmenován jako TiaA. Delece genu zrychlila produkci aktinorodinu a konstitutivní exprese genu naopak produkci zpomalila. Klíčová slova: ABC proteiny, ABC-F proteiny, Lmr(C), translace, rezistence k antibiotikům, Streptomyces coelicolor, aktinorodin
|
|
|
Mechanizmus účinku a rezistence na daptomycin
Helusová, Michaela ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Daptomycin patří mezi antimikrobiální peptidy, což jsou látky vyskytující se v obranném systému všech organismů. Molekula daptomycinu se skládá z cyklického peptidu a lipidové části. Daptomycin je produkován bakterií Streptomyces roseosporus a používá se k léčbě infekcí způsobených gram-pozitivními bakteriemi. Je účinný i proti některým multirezistentním kmenům bakterií jako je např. kmen Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu. Jeho antimikrobiální účinek je závislý na přítomnosti vápníku a fosfatidylglycerolu v cílové membráně, ve které tvoří oligomery. Jeho mechanizmus účinku tedy pravděpodobně tkví ve tvorbě pórů, které způsobují narušení membrány. Poškození membrány vede k výtoku iontů z buňky a tím k depolarizaci membránového potenciálu, což v důsledku způsobuje zastavení syntézy makromolekul a smrt buňky. Expozice daptomycinu také způsobuje změnu morfologie buněk. I přes neobvyklý mechanizmus účinku byly na působení daptomycinu vytvořeny různé mechanizmy rezistence u různých patogenních bakterií. Patří mezi ně např. snížení obsahu fosfatidylglycerolu v membráně, zvýšení podílu lysylfosfatidylglycerolu, uvolňování membránových lipidů nebo mutace v genech ovlivňujících syntézu peptidoglykanu.
|
|
|
Mikrobiální degradace výšemolekulárních polycyklických aromatických uhlovodíků
Bachmannová, Christina ; Cajthaml, Tomáš (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Polycyklické aromatické uhlovodíky jsou jedněmi z mnoha převážně antropogenních kontaminantů životního prostředí, které představují nebezpečí i pro lidské zdraví. Proto je potřeba získat co nejvíce poznatků o jejich degradaci a využít je v bioremediaci prostředí kontaminovaného těmito látkami. Zvláště polycyklické aromatické uhlovodíky s vyšší molekulovou hmotností jsou jen špatně rozpustné a tedy i málo biodostupné látky, z nichž benzo[a]pyren je prokázaný karcinogen a další byly shledány jako potenciální karcinogeny. V této práci popisuji znalosti o mikrobiálních degradačních dráhách polycyklických aromatických uhlovodíků podezřelých z karcinogenních účinků na lidský organismus a to benzo[a]pyrenu, benz[a]anthracenu, dibenz[a,h]anthracenu, benzo[k]fluoroanthenu, benzo[b] fluoroanthenu, chrysenu a indeno[1,2.3-c,d]pyrenu. Dále rozebírám hydroxylující dioxygenázy, dihydrodiol dehydrogenázy a štěpící dioxygenázy, tedy první enzymy mikrobiálního katabolismu uhlovodíků a jejich přizpůsobení degradaci výšemolekulárních polycyklických aromatických uhlovodíků. Klíčová slova: polycyklické aromatické uhlovodíky, Pseudomonas, biodegradation, benzo[a]pyren
|
|
|
Exprese genů pro konverzi nitrilů a amidů v Rhodococcus erythropolis
Kracík, Martin ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Kmen Rhodococcus erythropolis A4 je zdrojem enzymů nitrilhydratázy a amidázy katalyzujících konverze nitrilů a amidů. Tyto enzymy jsou používány při průmyslových biotransformacích a bioremediacích. Vzhledem k tomu, že genové manipulace vedoucí ke zvýšení produkce těchto enzymů bylo v kmeni A4 obtížné provést, byly v této práci identifikovány a analyzovány příslušné geny (ami a nha1+nha2) v příbuzném kmeni R. erythropolis CCM2595, v kterém lze manipulace s plazmidy i v chromozomu rutinně provádět. Geny ami a nha1+nha2 z kmene R. erythropolis CCM2595 byly izolovány a společně se sousedícími oblastmi (celkem 5,5 kb) sekvenovány. Byla zjištěna organizace těchto genů a předpokládaných regulačních genů v kmeni CCM2595 a zkoumán způsob regulace exprese těchto genů. Pro analýzu transkripce genů pro amidázu a nitrilhydratázu z obou kmenů R. erythropolis byl použit promoter-probe vektor pEPR1 replikující se v Escherichia coli a R. erythropolis, v němž byly zkonstruovány transkripční fúze promotorů Pami z kmene A4 i CCM2595 a reportérového genu gfp. Aktivita promotorů Pami byla měřena prostřednictvím fluorescence produktu genu gfp, zeleného fluoreskujícího proteinu. Měření fluorescence buněk nesoucích vektor pEPR1 s promotory genů ami z obou zkoumaných kmenů prokázalo, že jejich aktivita je převážně konstitutivní a...
|
|
|
Interakce chřipkového viru s buněčnými obrannými mechanismy
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Infekce chřipkovým virem patří mezi nejaktuálnější problémy dnešní doby. Unikátní schopnost tohoto viru silně inhibovat imunitní odpověď buněk na mnoha úrovních a jeho pandemický potenciál z něj činí předmět zájmu mnoha vědeckých skupin. Chřipkový virus používá k inhibici imunitní odpovědi především protein NS1. Protein NS1 je jednak schopen vázat se na RNA, a maskovat jí před rozpoznáním buněčnými senzory a dalšími proteiny. Protein NS1 obsahuje také katalytickou doménu. Pomocí této domény interaguje s mnoha buněčnými proteiny, zasahuje do signální transdukce a zajišťuje tak úspěch celé infekce. Protein NS1 je jedním z hlavních nástrojů patogenicity chřipkového viru a zaslouží si patřičnou pozornost.
|
|
|
Profil lakasové aktivity v kulturách houby Trametes versicolor během degradace endokrinně disruptivní látky Delor 103
Plačková, Martina ; Svobodová, Kateřina (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
V této práci byl studován endokrinně disruptivní potenciál Deloru 103 (směs kongenerů PCB) a jeho vliv na produkci a vlastnosti ligninolytického enzymu lakasy u houbové kultury Trametes versicolor. Byla prokázána androgenní aktivita Deloru 103 (EC50 = 2,29. 10-2 mg/l). Potenciální metabolity vznikající mikrobiální degradací této látky (chlorbenzoové kyseliny) vykazovaly estrogenní aktivitu, což naznačuje možné změny v hormonální aktivitě Deloru 103 v průběhu jeho mikrobiální degradace. Přítomnost Deloru 103 v kulturách T. versicolor v minerálním médiu stimulovala u houby vyšší produkci lakasy (až 257 krát), která vykazovala zároveň jiné izoformové složení než enzymy z kontrolních kultur. V komplexním médiu s Delorem 103 byla pozorovaná indukce produkce aktivního enzymu 64x nižší než u kultur rostlých v minerálním médiu. Dále bylo prokázáno, že indukce lakasy a produkce jejích různých forem závisela na stavu kultury v době přidání polutantu. Exponenciálně rostoucí kultury T. versicolor po přidání Deloru 103 produkovaly 7 různých pI forem lakasy, kdežto kultury v stacionární fázi růstu produkovaly pouze 4 formy o vyšším pI. Indukce lakasové aktivity u T. versicolor však nekorelovala s degradačním potenciálem kultur. Vyšší degradace (přibližně o 21 %) byla pozorována v kulturách rostlých v komplexním...
|
host ::
RSS.