|
|
Stavy patologické bolesti, úloha modulace míšního synaptického přenosu
Nerandžič, Vladimír ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci. Studie z poslední doby naznačují velký význam míšních presynaptických TRPV1 (transient receptor potential vanilloid) receptorů, které na periferii působí jako integrátory nociceptivních podnětů. Mechanismy jejich aktivace a jejich vliv na modulaci synaptického přenosu ale nejsou dosud zcela známy. Předchozí studie také ukázaly vliv řady mediátorů zánětu a cytokinů na funkci TRPV1 receptorů. Cílem naší studie bylo proto ukázat, jak se mění aktivace presynaptických TRPV1 receptorů v míše po aplikaci endogenního agonisty N-oleoyldopaminu (OLDA) u modelu periferní neuropatie, po inkubaci s cytokinemTNFα a jaký je účinek prekurzoru anandamidu N-acylfosfatidylethanolaminu (NAPE). V experimentech byly snímány miniaturní excitační postsynaptické proudy (mEPSC) na neuronech akutních míšních řezů metodou patch clamp. V první sérii experimentů byla testována citlivost na aplikaci endogenního agonisty OLDA 5 dnů po navození modelu periferní neuropatie. Aplikace již nízké koncentrace OLDA (0,2 μM) výrazně zvýšila frekvenci mEPSC na 250 % kontrolní hodnoty, na rozdíl od snímání u kontrolních experimentů kde je ke zvýšení potřeba vysoké koncentrace OLDA (10 μM). Inkubace řezů s TNFα ve druhé řadě pokusů u stejného...
|
|
|
Mobilizace vnitrobuněčného vápníku receptory pro acetylcholin muskarinového typu.
Šantrůčková, Eva ; Jakubík, Jan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Receptory pro acetylcholin muskarinového typu se účastní celé řady fyziologických i patofyziologických pochodů. Muskarinové receptory jsou metabotropní receptory pro acetylcholin. Hlavním cílem této práce bylo porovnat, jak krátkodobé vystavení jednotlivých podtypů muskarinových receptorů xanomelinu dlouhodobě ovlivňuje jejich funkční aktivitu. Muskarinové receptory se dělí do dvou skupin podle preferenčního typu G-proteinu - u lichých podtypů (M1, M3, M5) je to Gq/11, zatímco sudé podtypy (M2, M4) předávají signál do buňky hlavně přes Gi/o G-proteiny. Pro všechna měření byly použity CHO buňky stabilně exprimující jednotlivé podtypy muskarinových receptorů. Aby vápníková odpověď měla u všech podtypů srovnatelné parametry, byly buňky exprimující M2 a M4 receptory přechodně transfekovány cDNA pro lidský G-protein Gq/16. Hladina Ca2+ byla měřena pomocí fluorescenční sondy Fura 2. Vystavení xanomelinu vyvolalo na všech podtypech rychlé uvolnění Ca2+. V souladu s funkční selektivitou xanomelinu byla na M1 a M4 okamžitá vápníková odpověď na xanomelin srovnatelná s odpovědí na plného agonistu karbachol a zvýšená hladina vápníku přetrvávala hodinu po odstranění xanomelinu. Na druhé straně u M5 receptoru mělo krátkodobé vystavení xanomelinu dlouhotrvající antagonizující účinek na aktivaci karbacholem. Objasnění...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Měření membránového potenciálu u mutantních kmenů Saccharomyces cerevisiae deficientních v různých membránových transportérech
Džamba, Dávid ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Potassium transport across the cell membrane is supposed to contribute to the maintenance of membrane potential. In this work, the diS-C3(3) assay was used to determine the contribution of three main potassium transporters of S. cerevisiae cells (Trk1p, Trk2p and Tok1p) to the membrane potential changes in three different growth phases. It was shown that deletions of these transporters cause hyperpolarisation of the cell membrane in exponential and early diauxic growth phases; no difference was detected in post-diauxic cells. Another contribution of this work is in a deeper study of the activity of ABC pumps which are crucial in multidrug resistance. It was proved that apart from Pdr5p and Snq2p pumps, there are also other active extrusion pumps (most likely Pdr10p and Pdr15p). It was also showed that pdr1, pdr3 mutant strain is not an equivalent of strain lacking the multidrug pumps Pdr5p, Snq2p and Yor1p. The results in this work indicate that dis-C3(3) probe is probably a substrate of other pumps such as Pdr15p. Study of these transporters with our method is thus very suitable and could provide detailed information about their kinetics and help in finding their inhibitors.
|
|
|
Study of factors influencing the function of MntH, membrane transport protein of E. coli
Jurková, Ingrid ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Protein MntH patřící do rodiny transportérů Nramp hraje důležitou roli nejen v homeostáze železa a manganu, ale i při obraně bakteriálních buněk před imunitní reakcí napadeného hostitele. Tento protein transportuje do buňky dvojmocné kovové ionty v symportu s protony, přičemž stechiometrie tohoto transportu se mění v závislosti na membránovém potenciálu a na extracelulárním pH. V první části této práce byl pomocí redistribuční potenciálové sondy diS-C3(3) zkoumán vliv exprese MNTH a transportu dvojmocných iontů přenašečem MntH na membránový potenciál buněk E. coli. Zjistili jsme, že buňky exprimující MNTH jsou hyperpolarizovány a jejich membránový potenciál se depolarizuje po přidání některých dvojmocných kovů. Ve druhé části práce jsme se věnovali teoretickému studiu kinetiky membránových přenašečů popsaných čtyř-, šesti- nebo osmistavovým transportním modelem, do něhož byla zavedena závislost všech rychlostních konstant na membránovém potenciálu. Pomocí matematického modelování byla zkoumána závislost toku přenašečem na různých parametrech transportního modelu, jako jsou například membránový potenciál, koncentrace substrátu nebo náboj substrátu či přenašeče. Byly pozorovány některé jevy, popisované i u proteinu MntH (proměnná stechiometrie transportu a její závislost na potenciálu a pH). Pro detailnější...
|
|
|
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...
|
|
|
Topologie a funkce transmembránové domény kolicinu U, bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Kolicin U produkovaný kmeny bakterie Shigella boydii je protein, který je schopen působit lyticky na blízké bakteriální kmeny Shigella a Escherichia. Na základě sekvenční podobnosti s koliciny A, B a N se řadí mezi pórotvorné koliciny. Interakce kolicinu s napadenou bakterií je zajištěna třístupňovým mechanizmem:1) Nejdříve interaguje centrální doména kolicinu s receptory vnější membrány OmpA, OmpF. 2) Dále je kolicin prostřednictvím N-terminální domény a její interakce s Tol proteiny přenesen do periplazmy a nakonec 3) C-terminální doména interaguje s vnitřní membránou napadené bakterie a způsobuje její depolarizaci. V předkládané práci byla prokázána pórotvornost kolicinu U a dále podrobně studovány vlastnosti těchto pórů pomocí elektrofyziologických metod (měření na černých lipidových membránách). Byla stanovena vodivost jednotlivých pórů (19 pS), jejich iontová selektivita, byl sledován vliv změny různých podmínek na chování pórů. Tyto poznatky, v mnoha případech, odpovídaly zjištěním o jiných příbuzných kolicinech (koliciny A, B, N). Dále byl určován průměr póru (≈ 0,8 nm). V další části práce byly vytvořeny jednobodové cysteinové mutace v rámci pórotvorné domény kolicinu U, následně bylo vyprodukováno pět mutantních variant kolicinu U a na závěr byla ověřena jejich funkčnost tak, aby mohly...
|
|
| |
host ::
RSS.