|
|
Heat-induced stress granules of Saccharomyces cerevisiae.
Groušl, Tomáš ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Sychrová, Hana (oponent)
(česky) Jedna ze základních charakteristik živých organismů je snaha adaptovat se na měnící se životní podmínky. Regulace translace poskytuje rychlý a široce použitelný mechanismus pro realizaci stresem indukovaných změn. Komplexy mRNA molekul a asociovaných proteinů, které se účastní translace a dalších procesů spojených s mRNA molekulami, podléhají vlivem stresu strukturním změnám. Tyto změny mohou vést k akumulaci zmíněných komplexů do struktur vyššího řádu, jako jsou stress granules (stresové granule) nebo processing bodies. O dalším osudu mRNA molekul a některých součástí translačního aparátu buňky za stresu, se rozhoduje prostřednictvím právě těchto akumulací. Ve snaze detailně porozumět úloze stresových granulí v buněčném metabolismu, jsme v naší laboratoři blíže analyzovali teplem indukované stresové granule kvasinkového modelového organismu Saccharomyces cerevisiae. Zjištěním, že se stresové granule tvoří také v tomto jednobuněčném eukaryotickém organismu, jsme přispěli k poznání, že fenomén stresových granulí je evolučně konzervovaný napříč eukaryotickou říší. Teplem indukované stresové granule kvasinky S. cerevisiae se podobají stresovým granulím evolučně vyšších eukaryot složením a v navrhovaných metabolických funkcích. Nicméně, tyto granule jsou také v některých ohledech jedinečné a...
|
|
|
Biochemická a molekulární podstata specifických vlastností nekonvenčních osmotolerantních kvasinek
Dušková, Michala ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Jednobuněčné organismy jako například kvasinky jsou neustále vystavovány měnícímu se okolnímu prostředí, zvláště pak změnám koncentrace osmoticky aktivních látek. Kvasinkové druhy schopné čelit těmto měnícím se podmínkám lépe, jsou považovány za osmotolerantní (Zygosaccharomyces rouxii, Pichia sorbitophila, Debaryomyces hansenii, apod.). Osmotolerance kvasinek závisí na řadě fyziologických parametrů, ale nejdůležitější vlastností je účinný metabolismus tzv. vnitřních osmolytů. Tuto úlohu zastupuje ve většině kvasinkových druhů malá molekula glycerolu. Při hypoosmotickém stresu se kvasinky zásob glycerolu zbavují, při adaptaci na vysoký osmotický tlak (hyperosmotický stres) naopak glycerol syntetizují a akumulují. Modelová Saccharomyces cerevisiae má dva transportní systémy pro glycerol, kanál ScFps1 sloužící především pro vypouštění glycerolu v případě hypoosmotických podmínek a současně také přenašeč ScStl1 akumulující glycerol v průběhu hyperosmotického stresu. V rámci této práce byly nejprve detailně studovány fyziologické vlastnosti tří výše zmíněných nekonvenčních osmotolerantních druhů. Bylo zjištěno, že i přestože se tyto druhy příliš neliší od modelové S. cerevisiae v základních morfologických vlastnostech, jejich rozdílnost spočívá především ve schopnosti přežívat vysychání, vyrovnávat se...
|
|
|
Role of translational elongation factors in dynamics of stress granules.
Hlaváček, Adam ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Translační faktor eIF5A se pravděpodobně podílí na iniciaci i elongaci. Existují také zmínky o jeho roli v tvorbě P-bodies. Vzhledem k podobnosti P-bodies a stressových granulí (SGs) jsme se rozhodli otestovat roli eIF5A v dynamice teplem-navozených SGs a jeho důsledky pro zotavení buněk. Pro hodnocení funkce eIF5A v tvorbě SGs byla použita teplotně citlivá (ts) mutanta eIF5A-3 (C39Y/G188D) kultivovaná za permisivní teploty 25řC, s Rpg1-GFP fúzním proteinem jako značkou SGs. Buňky byly vystaveny robustnímu tepelnému šoku 46řC po 10 minut. Schopnost mutovaných buněk přežít byla testována propidium iodidovým barvením a výsevem jednotek tvořících kolonie (CFU). Zjistili jsme, že mutanta eIF5A-3 tvoří teplem navozené SGs, které agregují volněji. To naznačuje, že pro skládání SGs je nutný plně funkční eIF5A. Nicméně mutace nejeví dopad na míru rozpouštění SGs. Testy přežívání ukazují, že mutanta eIF5A-3 je citlivá vůči buněčné smrti obdobně jako WT buňky, avšak její schopnost znovu nastolit proliferaci je znatelně lepší. Pozorovali jsme také ztrátu ts fenotypu eIF5A-3 mutanty. Tyto změny vlastností nebyly způsobeny zpětnou změnou mutované sekvence genů pro eIF5A. Jejich pravděpodobná příčina leží v adaptivní evoluci. Naše výsledky také naznačují účast eIF5A v aktinové dynamice. Navrhujeme, že účast eIF5A v...
|
|
|
Function and localization of the SUN family of proteins in yeast populations
Kuznetsov, Evgeny ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Malcová, Ivana (oponent)
Rodina SUN proteinů (Uth1p, Sun4p, Sim1p, Nca3p) je skupina proteinů vyskytujicích v houbach a podobných glucanazům bunečny steny. SUN proteiny mají vysokou homologie v jejich C-terminalní doméně která je 256 aminokyselin dlouhá. Naše předchozí studium vývoje kvasinkových koloní odhalilo, že členy rodiny SUN proteinů mohou byt zapojený do procesu stárnutí a také mohou hrát důležitou roli pro přežívaní během vývoje a růstu mnohobunečné kvasinkové populace. V naší laboratoři jsme provedli microarray analýzu změn expresí genů v koloních, ktera ukázala výrazné změny v urovni exprese člena SUN rodiny UTH1. Kmen s deletovaným UTH1 genem vykazuje zpomalenější růst a horší přeživaní v kvasinkových koloních při porovnaní s wild type kmenem. Nicméně v své práci jsem se soustředil na identifikaci a ziskaní vice informací o funkcích jednotlivych SUN proteinů a zjištění jejich přesné lokalizace. Je zajimavé, že nekteré SUN proteiny mají duální lokalizaci (Uth1p a Sun4p) v mitochondrích a buněčné stěně a mohou byt spojeny s jejich funkcí. V této disertační práci, kapitola "Results and discussion" byla rozdělena na dvě části: první adresovaná otázkám, které se týkají lokalizace, regulaci zavislé na kysliku a možne zapojení SUN proteinů v remodelaci buněčné stěny. Druhé časti předcházel vývoj nové metody...
|
|
|
Cílené vyhledávání genů sekundárního metabolismu ve streptomycetách.
Bakal, Tomáš ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Objevy nových přírodních antibiotik jsou dnes již vzácností, proto se jako velmi perspektivní možnost zisku nových antibiotik a látek se zajímavou biologickou aktivitou jeví konstrukce kmenů produkujících hybridní látky. Tato práce je součástí širšího projektu zaměřeného na přípravu nových biologicky aktivních látek odvozených od antibiotika linkomycinu. Linkomycin se skládá z cukerné (MTL) a aminokyselinové (kyselina propylhygrová) složky spojených peptidovou vazbou. Je známo, že nejrůznější modifikace aminokyselinové části molekuly, zvláště pak bočního alkylového řetízku, vedou ke zlepšení antibiotických vlastností výsledné látky. Úzkým hrdlem syntézy takto modifikovaných látek je kondenzační enzym NDL-syntetáza a především jeho A-doména, která, stejně jako u nonribozomálních peptidových syntetáz (NRPS), specificky rozpoznává a aktivuje aminokyselinový prekurzor. V rámci této práce byla navržena sada degenerovaných primerů pro vyhledávání A-domén NRPS metodou PCR a byly optimalizovány podmínky reakce. Zdrojem genetické informace pro vyhledávání zajímavých A-domén NRPS, použitelných pro konstrukci hybridních biosyntetických shluků, bude v první fázi sbírka cca 800 půdních izolátů aktinomycet. Kmeny této sbírky byly charakterizovány taxonomicky (sekvenace 16S rDNA) a sbírka byla utříděna (byly vyloučeny...
|
|
|
Příprava a charakterizace proteinu LmbX zúčastněného v biosyntéze antibiotika linkomycinu
Jiráčková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Linkomycin je antibiotikum využívané v klinické praxi. Jeho producentem je Streptomyces lincolnensis. Linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové složky, které jsou spojeny amidovou vazbou. Aminokyselinovým prekurzorem je propylprolin (PPL), jehož biosyntéza probíhá dráhou vycházející z tyrosinu. Modifikovaná PPL dráha byla také objevena u pyrrolobenzodiazepinů (PBD) a hormaomycinu. V biosyntéze PBD je PPL prekuzor dále modifikován reakcemi katalyzovanými specifickými enzymy nepřítomnými v biosyntéze linkomycinu. Geny kódující tyto enzymy by mohly být přeneseny do genového shluku pro biosyntézu linkomycinu. Tímto způsobem bychom mohli získat producenty hybridních antibiotik s lepšími vlastnostmi, a dokonce antimalarickými účinky. PPL dráhy se účastní šest enzymů, které jsou kódovány v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu. První dvě reakce biosyntézy PPL byly již prokázány, proto se tato práce zaměřuje na reakci třetí, kterou by měl podle literatury katalyzovat protein LmbX. Jeho předpokládaná funkce v biosyntéze PPL je hydrolýza C-C vazby. Podle sekvenční homologie však protein LmbX patří do rodiny isomeras. V této práci byl nadprodukován protein LmbX a byla testována jeho aktivita v přítomnosti předpokládaného substrátu. Produkty byly měřeny na kapalinovém chromatografu (UHPLC)....
|
|
|
Role proteinu Prp45 v expresi a zrání mRNA
Abrhámová, Kateřina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Souhrn Prp45p ze Saccharomyces cerevisiae a Snw1p ze Schizosaccharomyces pombe jsou pro eukaryotní buňku nepostradatelné proteiny, které vykazují vysoký stupeň homologie se savčím transkripčním regulátorem a nestřihovým faktorem SNW/SKIP. Analyzovali jsme esenciální funkci těchto proteinů v obou kvasinkách a nalezli mutaci (prp45(1-169)), která u mutantního kmen s odpovídající chromozomální delecí způsobuje citlivost vůči vyšší kultivační teplotě a hypersenzitivitu vůči cykloheximidu, hydroxymočovině, látce calcofluor white a inhibitorům polymerizace mikrotubulů. Při kultivaci ve 30řC jsou tyto kvasinky často prodloužené, deformované a větší než wt. Po synchronizaci ve 37řC zastavují kvasinky prp45(1-169) svůj růst s dvojnásobným obsahem DNA. Zjistili jsme, že teplotní senzitivita kmene prp45(1-169) není překonána a hypersenzitivita vůči mitotickým jedům je jen částečně potlačena odstraněním intronu z genu TUB1. To odlišuje prp45(1-169) od těch mutant v sestřihových faktorech, jež vykazují na tubulinu závislý blok v G2/M fázi, který může být překonán pomocí verze tub1 bez intronu . Pomocí analýzysestřihu in vitro jsme zjistili, že sestřih optimálních substrátů není narušen. Porovnávali jsme stabilitu a obsah RNA mezi prp45(1-169) a wt kvasinkami při různých teplotách pomocí microarray analýzy. Expresi a...
|
|
|
Produkce amoniaku koloniemi mutantů a stárnutí strukturovaných kolonií Saccharomyces cerevisiae
Nedbálková, Jana ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Janderová, Blanka (vedoucí práce)
Produkce amoniaku koloniemi mutantů a stárnutí strukturovaných kolonií Saccharomyces cerevisiae Cílem této diplomové práce je sledovat vývoj, respektive stárnutí buněk v kvasinkových koloniích Saccharomyces cerevisiae. Kvasinkové buňky S. cerevisiae tvoří na pevném substrátu mnohobuněčné organizované struktury - kolonie, ve kterých dochází k mezibuněčným interakcím. Tyto interakce mají vliv na formování, morfologii a stárnutí kvasinkové kolonie. Tato práce je zaměřena na změny v produkci amoniaku obřími koloniemi delečních mutant, a také na stárnutí kolonií se zvrásněnou morfologií. Charakterizovala jsem mutantní kmeny S. cerevisiae, s delecí v genech RTG1, RTG2, RTG3, FIS1, CIT2, jejichž produkty hrají významnou roli ve vývoji kolonie. Transkripce těchto genů se mění v průběhu vývoje kolonií při přechodu z acidické do alkalické fáze. Zjistila jsem, že míra produkce amoniaku byla ve shodě s výsledky alkalizace média v okolí obřích kolonií a že uvedené mutanty odvozené od kmene BY produkovaly amoniak od 15. dne. Míra produkce amoniaku koloniemi kmene rtg3∆ byla srovnatelná s rodičovským kmenem, nižší produkce oproti rodičovskému kmeni byla zjištěna u fis1∆, rtg1∆ a rtg2∆. Naopak u kmene cit2 byla produkce amoniaku vyšší-než u rodičovského kmene. Připravila jsem kmeny S. cerevisiae ƩSh , u kterých jsem pomocí...
|
|
|
Využití kvasinek ve vývoji nových antivirotik
Dubská, Jitka ; Janderová, Blanka (oponent) ; Mašek, Tomáš (vedoucí práce)
The increase of infectious chronic diseases is the main health problem of modern civilization. These diseases, which are spread both in developing as well as industrial countries, cause more than 59% of all life ends. Statistically, the most frequent infection is hepatitis C virus (HCV) infection. Incurable hepatic illnesses such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma are the outcomes of the HCV infection and the liver transplantation is the only successful therapeutic option for the patients in industrial countries. It is estimated that about 170 million people worldwide are chronically infected with this virus. HCV is a small coated virus with single stranded RNA genome of positive polarity. Lots of research has been done since it was discovered twenty years ago but the efficient drug is still missing. There is a strong tendency to focus the research on searching for translation initiation inhibitors in last few years, because the whole life cycle of HCV, including RNA replication, new virions assembly etc., is dependent on translation products. Nowadays there is a small group of human proteins (so called ITAFs) known for up- or down-regulate HCV and other viruses translation initiation. It is believed, that this group is much more comprehensive. The aim of this diploma work was to construct yeast...
|
|
| |
host ::
RSS.